Holber Zuleta Prada, por compartir sus conocimientos y lo más importante por su extraordinaria disponibilidad para aclarar dudas, sus valiosas sugerencias en la investigación y gracias de antemano por orientar la tesis. Amparo Máxima Borja de la Rosa, por toda la atención y apoyo durante mi formación en el máster. El musgo fue colectado en el poblado de La Mojonera, Zacualtipán de Ángeles, Hidalgo.
Se evaluaron las propiedades antioxidantes en los extractos acuoso, metanólico, AcOEt y hexano, cuantificando los fenólicos y flavonoides totales y evaluando la capacidad antioxidante con los ensayos DPPH, FRAP y ABTS.
INTRODUCCIÓN
Objetivo General
Objetivos particulares
REVISIÓN DE LITERATURA
Pilotrichella flexilis (Hedw.) Angstr
En el que se describe el aislamiento y caracterización de biflavonoides (Tabla 2.1) (Seeger et al., 1992; Brinkmeier et al., 2000). La formación de radicales libres en los sistemas biológicos se atribuye a la presión biótica o abiótica en el medio ambiente (Basile et al., 2011; Garg & Manchanda, 2009). La curiosidad por estudiar la bioactividad de extractos crudos o fraccionados en briofitas surge de la evidencia de su uso en la medicina tradicional en Europa, China, India y América del Norte, que resalta sus propiedades antibacterianas (Glime, 2007; Nikolajeva. et al., 2012).
La actividad antibacteriana dependerá de la composición química específica, la configuración estructural de los compuestos, los grupos funcionales y las interacciones entre los compuestos (Bukviĉki, Veljić, Soković, Grujić y Marin, 2012; Nikolajeva et al., 2012).
ESTUDIO FITOQUÍMICO DE Pilotrichella flexilis
- Obtención del material vegetal
- Preparación de extractos
- Aislamiento y purificación de metabolitos secundarios
- Análisis espectroscópico de los productos aislados
- Caracterización completa del Lup-20(29)-eno (1)
Estos últimos organismos carecen de cuerpos oleosos, a diferencia de las hepáticas, de las que se han aislado más de 1.000 metabolitos secundarios. Un ejemplar fue depositado en el Herbario Preparatorio Agrícola de la Universidad Autónoma Chapingo (UACh) con número de Registro 34591). A partir de las fracciones 1-64 eluidas con hexano al 100%, después de la purificación mediante cromatografía ultrarrápida en columna (TLC), se obtuvo el hidrocarburo triterpénico Lup-20(29)-eno (1) como un sólido amorfo blanco.
Estos compuestos se identificaron basándose en sus datos espectroscópicos, CCD y en comparación con datos de la literatura. Por otro lado, la asignación completa de las señales en los espectros unidimensional y bidimensional fue posible mediante el uso de los sistemas de procesamiento de datos NMRPIPE, Sparky y TOPSPIN versión 3.1. De las fracciones Hex-AcO) de la columna original se realizó una segunda separación cromatográfica que permitió purificar un sólido cristalino de color blanco en las fracciones 28-60, en la mezcla de elución hexano-AcOEt 95:5, cuyo Rf: 0. 54.
El sólido se comparó mediante cromatografía en capa fina con una muestra aislada y ya identificada en el laboratorio (Fig. 3.6), el perfil cromatográfico de las fracciones coincidió con la referencia previamente aislada. Los datos obtenidos por 1H NMR se compararon con los informados previamente en la literatura para β-sitosterol y estigmasterol. Se observó que los datos espectrales experimentales coincidían con los datos espectrales de la literatura para β-sitosterol y estigmasterol, por lo que se revisaron estudios previos sobre esteroles extraídos de plantas y se observó que β-sitosterol y estigmasterol son isómeros comunes. en la naturaleza se mezcla y es muy difícil de separar (Chaturvedula. & Prakash, 2012).
Por lo tanto, basándose en los datos de punto de fusión, Rf y RMN 1H, se considera suficiente para no tener dudas sobre la estructura propuesta. Los triterpenos están ampliamente distribuidos en el reino vegetal y se encuentran en diversas partes de las plantas, y también se les han atribuido actividades biológicas (Dewick, 2002). Otro grupo de terpenos son los esteroides; los principales fitoesteroides como campesterol, sitosterol y estigmasterol se encuentran en la mayoría de las briofitas (Mues, 2000), en P.
Caracterización por cromatografía de gases/espectrometría de masas del extracto no polar de las hojas de Clusia minor L.
EVALUACIÓN DE LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE DE CUATRO
- Equipo
- Reactivos
- Material Vegetal
- Actividad Antioxidante
- Análisis estadístico
Dentro de la clasificación general se encuentran los fenoles, ácidos fenólicos y flavonoides, los cuales constituyen un amplio grupo de sustancias químicas consideradas metabolitos secundarios de las plantas, con diferentes estructuras y propiedades químicas (Cheynier, Comte, Davies, Lattanzio, & Martens, 2013). 51 | P a g e Estos compuestos absorben la radiación en el rango UV del espectro electromagnético y protegen el tejido vegetal más sensible de la radiación solar. Por tanto, la capacidad antioxidante de la muestra se evalúa en función de la capacidad de reducir la concentración del radical (Re et al., 1999).
La medición de absorbancias para cuantificar fenólicos totales y flavonoides totales y evaluar la capacidad antioxidante se realizó en un lector de microplacas equipado con bombas de inyección automáticas y el software de análisis de datos Gen5TMdata (Biotek Instruments Inc., Winooski, VT, EE. UU.). La ecuación obtenida de la curva se utilizó para determinar la concentración de fenoles totales en la muestra. Finalmente, se transfirieron 200 µl de cada muestra a pocillos de microplaca y se midió la absorbancia a 510 nm.
Donde Muestra, Ablanco, Acontrol representan la absorbancia del antioxidante de referencia o la muestra, el blanco y el control. El porcentaje de reducción de DPPH se representó frente a las concentraciones de las muestras y la concentración inhibidora 50 (CI50) se calculó a partir de la ecuación de regresión obtenida. Estos metabolitos secundarios afectan a diversas funciones dentro de la planta, como la asimilación de nutrientes, la síntesis de proteínas, la actividad enzimática, la fotosíntesis, la alelopatía, etc.
La influencia de la polaridad en los solventes para la extracción de compuestos relacionados puede estar relacionada con la diferencia significativa entre el contenido de compuestos fenólicos en los extractos (Sreejith et al., 2013). Según datos de la literatura, los musgos tienen una alta producción de flavonoides en comparación con otros grupos de briofitas (48% musgos, 40% hepáticas). En el presente estudio se utilizaron tres ensayos diferentes (ABTS, DPPH y FRAP) para evaluar la capacidad antioxidante, según la literatura es aconsejable utilizar más de un método para la evaluación de la capacidad.
59 | P a g e antioxidante en extractos de plantas, aquellos extractos que actúan de la misma manera, al utilizar otras técnicas que actúan con mecanismos diferentes, la tendencia de los resultados para cada uno de los extractos se fortalecerá.
ACTIVIDAD ANTIBACTERIANA in vitro DE LOS EXTRACTOS DE P. flexilis
- Obtención del material vegetal
- Preparación de los extractos
- Suceptibilidad bacteriana por método colorimétrico usando Cloruro de
- Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
- Análisis Estadístico
- Actividad Antibacteriana
- Concentración Mínima Inhibitoria
Para evaluar la susceptibilidad de los microorganismos existen varios métodos que pueden ayudarnos a obtener respuestas sobre esta capacidad en extractos o compuestos activos. Los métodos colorimétricos han sido propuestos como alternativas prometedoras para evaluar pruebas de susceptibilidad en microorganismos. Estos métodos consisten en el uso de sales de tetrazolio como reductores que indican células metabólicamente activas, dando lugar a formazán soluble, este resultado se puede cuantificar fácilmente en un equipo lector de placas medido frente a una absorbancia que dependerá del reactivo utilizado (Li et al., 2010; Tunney, Ramage, Field, Moriarty y Storey, 2004). Se preparó una solución madre de los cuatro extractos (acuoso, metanol, AcOEt y hexano), se pesaron 0,1 g y se diluyeron en 20 ml de DMSO al 10%. Se colocaron las diferentes cantidades en cada uno de los pocillos, se agregó caldo nutritivo respectivamente y finalmente se agregaron 50 μL de bacterias.
72 | Página Se escaneó la microplaca y el sedimento formado en los pocillos se leyó a una absorbancia de 540 nm en un lector de microplacas Biotek Brand Synergy 2 para obtener datos cuantitativos sobre la inhibición de los extractos sobre las bacterias. Luego de identificar la concentración con mayor actividad, los extractos se compararon mediante la prueba de Kruskall-Wallis, teniendo en cuenta la independencia de las preparaciones. Los extractos evaluados mostraron diferencias significativas entre las concentraciones y los extractos de las cepas evaluadas en este estudio. Los resultados estadísticos de las pruebas analizadas se describen a continuación.
La tendencia indica que a una concentración de 3,75 mg/mL, los extractos de metanol y AcOEt tienen un rango de absorbancia más bajo y, por lo tanto, una actividad más alta. No hay diferencia significativa entre los extractos acuoso, metanólico y AcOEt (suma de rangos = 7, 16 y 18 respectivamente, p = 0,001), el extracto de hexano pareció ser el menos efectivo y significativamente diferente con respecto a los otros extractos (suma de la serie = 32, p < 0,01). Derivado del análisis de los datos estadísticos, los extractos con mayor efecto inhibidor sobre las bacterias estudiadas fueron el extracto metanólico y acetato de etilo, las concentraciones aplicadas a los microorganismos fueron 5.00 mg/mL, según la definición de CIM, las concentraciones que la inhibición del crecimiento bacteriano visible para Clavibacter fue de 5 mg/ml para el extracto de AcOEt, el extracto de metanol no se inhibió a la concentración más alta probada, Xanthomonas fue sensible a los dos extractos probados (metanol y AcOEt) la concentración inhibidora mínima fue de 4,5 mg/ml para ambos extractos.
Escherichia coli fue sensible a las concentraciones más altas probadas pero no mostró inhibición visible, por lo que no se consideró una CMI para ninguna de las concentraciones evaluadas. Microccocus mostró una alta sensibilidad hacia los extractos de metanol y AcOEt, a diferencia de E. El método de microdilución con caldo, combinado con un agente reductor como las sales de tetrazolio (TTC), es conveniente y ampliamente utilizado para pruebas rápidas de susceptibilidad en poco tiempo ( Lee , Lee, Jeong, & Chang, 2007;Rahman, Kühn, Rahman, Olsson-Liljequist, & Möllby, 2004. El uso de cepas bacterianas importantes para la agricultura y patógenas para los humanos representa un modelo en este trabajo de acción inhibidora de extractos que difieren en microorganismos.La inhibición mostrada para los extractos evaluados sobre los cuatro tipos de bacterias muestra una variabilidad del efecto para las diferentes concentraciones y el tipo de extracto. Es importante resaltar que el uso de solventes de diferente polaridad implica la probable extracción de mezclas. de diferentes compuestos asociados a la actividad biológica; Es decir, un extracto obtenido que contiene un disolvente altamente polar.
Otro ejemplo en el que se utilizaron bajas concentraciones de extracto fue descrito en un estudio sobre Plagiochasma appendiculatum, con valores que oscilaron entre 0,1 y 0,2 mg/mL para los extractos: cloroformo, acetona, etanol y soluciones acuosas de M.
