Esta activación conduce a la expresión de microARN (miARN), que desempeñan un papel principal en la regulación de proteínas en diversos procesos celulares, incluida la producción de IL-10. El objetivo de este trabajo fue evaluar el papel de TLR2 en la regulación de IL-10. Utilizando herramientas bioinformáticas, integramos la información obtenida con bases de datos de interacciones validadas entre miARN y proteínas de ARN mensajero de la vía TLR2/IL-10.
Se descubrió que los miembros de la familia let-7-5p y miR-27b-3p influyen en la regulación directa de la transcripción de IL-10; mientras que miR-146b-5p y miR-155-5p podrían regular la expresión de la citoquina a nivel de señalización. Esta activación conduce a la expresión de microARN (miARN), que tienen un papel importante en la regulación de proteínas implicadas en varios procesos celulares, incluida la producción de IL-10. El objetivo de este trabajo fue evaluar el papel de TLR2 en la regulación de IL-10.
Using bioinformatics tools, we integrated the obtained information into a database of valid interactions within miRNA and messenger RNA of key proteins from the TLR2/IL-10 pathway. Members of let-7-5p and miR-27b-3p were found to have an impact on the direct regulation of IL-10 transcript, while miR-146b-5p and miR-155-5p can regulate the expression of the same cytokine at the signaling level.
INTRODUCCION
Se ha demostrado que los miARN participan en la regulación de la respuesta inmune y en la respuesta a bacterias probióticas o con potencial probiótico. En este trabajo de investigación se investigó la regulación de la IL-10 mediante miRNAs y la participación del receptor TLR2 en este proceso con el fin de profundizar en los mecanismos reguladores de esta citocina en la respuesta inmune a los probióticos.
ANTECEDENTES
- IL-10
- Bacterias Benéficas
- Receptores Tipo Toll
- Descripción
- Señalización TLR2
- MicroRNAs
- Historia
- Biogénesis y Procesamiento
- Regulación Génica por MiRNAs
- MiRNAs en Respuesta a Microorganismos
La IL-10 en macrófagos inhibe aproximadamente el 20% de los genes proinflamatorios inducidos por lipopolisacáridos (LPS) de bacterias gramnegativas (Lang et al., 2002). Cuando STAT3 se transloca al núcleo, se induce la expresión de elementos implicados en la respuesta antiinflamatoria, como proteínas que inhiben NF-κB y citoquinas proinflamatorias, como TNF-α e IL-12b (Hutchins et al. , 2013). Existe evidencia científica de que estos microorganismos, incluso inactivados, tienen efectos beneficiosos para la salud (Kataria et al., 2009).
En particular, la inducción de la producción de IL-10 por la acción de los probióticos se ha estudiado ampliamente, porque el equilibrio entre la IL-10 y las citoquinas proinflamatorias secretadas por los macrófagos y las CD en respuesta a los microorganismos es crucial para la determinación de la respuesta inmune. (Kaji et al., 2010). Estos son reconocidos por receptores de reconocimiento de patrones (PRR) presentes en células inmunes como monocitos, macrófagos, neutrófilos y DC (Lebeer et al., 2010). Las células eucariotas tienen un repertorio diverso de pequeños transcritos no codificantes llamados microARN o miARN, que tienen aproximadamente entre 16 y 27 nucleótidos de longitud (Guo et al., 2013).
Para ejercer su función, los miRNA pueden bloquear el inicio de la traducción, reprimirla una vez que ha comenzado o desestabilizar el mRNA matándolo (Kishore et al., 1999; Knödler et al., 2009). La biogénesis de los miARN está estrechamente regulada, lo que da como resultado patrones de expresión de miARN específicos de diferentes organismos, tejidos, tipos de células y etapas de desarrollo (Slezak-Prochazka et al., 2010). Los genes que codifican miARN se ubican en exones e intrones de genes de ARNm (Rodríguez et al., 2004; Ying y Lin, 2006).
Aunque Dicer es una enzima fundamental en el procesamiento de miARN, se ha identificado una vía de biogénesis de miARN independiente de Dicer que utiliza la actividad de escisión catalítica de la proteína Argonaute-2 (AGO2) (Cifuentes et al., 2010). La inhibición de la expresión genética es el mecanismo predominante; sin embargo, existen informes sobre la estimulación genética inducida por miARN (Lee y Vasudevan, 2013; Ritchie et al., 2009b; Vasudevan et al., 2007). En los seres humanos, existen cuatro proteínas AGO diferentes, siendo AGO2 la más abundante (Wang et al., 2012).
Esta respuesta se caracteriza por cambios en la expresión genética que requieren una regulación precisa para generar una respuesta inmune adecuada (Gat-Viks et al., 2013; Liu y Cao, 2015), proporcionando así la máxima protección contra infecciones y evitando daños a los tejidos. Los datos experimentales muestran que el repertorio de miARN de las células huésped se altera en respuesta a infecciones microbianas (Eulalio et al., 2012). En trabajos previos, se ha observado un aumento en la expresión de miR-147, miR-21 y miR-9 en respuesta a ligandos de TLR y citocinas proinflamatorias, en CD y macrófagos (Taganov et al., 2006; Bazzoni et al. . ., 2006; Bazzoni et al., 2006). otros, 2009).
En macrófagos derivados de la médula ósea, la expresión de miR-155 se indujo en respuesta a varios ligandos de TLR (O'Connell et al., 2007). En otro estudio, se demostró que durante la infección intracelular con Mycobacterium bovis bacillus Calmette-Guérin, la expresión de miR-29 disminuye, aumentando así la producción de IFN-γ (Feng et al., 2011).
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
Objetivo General
Objetivos Específicos
MATERIALES Y MÉTODOS
Preparación de Bacterias
Obtención de Sangre Periférica
Obtención de Monocitos
Estimulación de Monocitos con Bacterias
Análisis de la Expresión de Genes y MiRNAs
- Análisis de la Expresión de Genes
- Análisis de la Expresión de MiRNAs
- Expresión de miRNAs por microarreglo
- Expresión de miRNAs por RT-qPCR
Secuencias de cebadores y sondas utilizadas para el análisis de expresión génica mediante RT-qPCR. A partir del ARN total se analizó la expresión de 407 secuencias maduras de miARN de Sus scrofa en monocitos estimulados. EE.UU). CADN se sintetizó en un mini termociclador MJ (Bio-Rad, EE. UU.) Se usaron 50 ng de ARN total para cada reacción. MJ mini (Bio-Rad, EE. UU.) Se usaron 50 ng de ARN total para cada reacción de retrotranscripción.
Para la cuantificación de secuencias de miARN maduros se utilizó 1 μl de ADNc (diluido 1:4), 2 μl de 5x HOT FIREPol® EvaGreen®qPCR Mix Plus (ROX) y una concentración de 250 nM de cada cebador, todo en un volumen últimos 10 µl. Las secuencias de cebadores para la detección de miARN en cerdos se tomaron de las informadas por Mentzel y colaboradores (2014) o se diseñaron utilizando. Secuencias de cebadores utilizados para el análisis de expresión de miARN mediante RT-qPCR.
Predicción de MiRNAs y Proteínas Blanco
Expresión relativa de IL-10 mediante RT-qPCR en monocitos estimulados con Bb12 a diferentes concentraciones de anti-TLR2. Las bacterias pertenecientes a los géneros Lactobacillus y Bifidobacterium tienen la capacidad de modular la producción de IL-10 en monocitos (Čitar et al., 2014) y una de las formas en que se produce es mediante la activación de TLR2. Por tanto, se determinó si la expresión de IL-10 fue inducida por la interacción de Bb12 con TLR2 o por algún metabolito bacteriano.
Por tanto, podemos confirmar que tras 4 h de estimulación, la expresión de IL-10 es inducida principalmente por la interacción de Bb12 con TLR2 y no por ningún metabolito bacteriano. Expresión relativa de IL-10 por RT-qPCR en monocitos estimulados con sobrenadante de Bb12 (Bb12SN). La activación de MAPK es necesaria para la inducción de la producción de IL-10 por parte de TLR (Akira y Takeda, 2004).
En monocitos y macrófagos, se ha demostrado que NF-κB regula directamente la transcripción de IL-10 uniéndose al promotor il10. Sin embargo, la señalización de ERK y p38 también participa en la regulación de la transcripción de IL-10 en macrófagos y CD (Saraiva y O'Garra, 2010). Esto podría indicar que NF-κB no es el factor de transcripción principal o parcial de la expresión de IL-10 en nuestro estudio.
Al estimular los macrófagos con bacterias vivas o componentes microbianos, se inhibe la expresión de varios miembros de la familia let-7, reduciendo la supresión de citocinas como IL-6 e IL-10 (Schulte et al., 2 Liu et al., 2011). Determinación de proteínas diana que participan en la vía TLR2/IL-10 utilizando MiRNA en respuesta a Bb12. La Figura 10 muestra un diagrama del mecanismo propuesto de regulación de IL-10 por miARN en respuesta a Bb12.
Además, está dentro de los 20 miARN que se dirigen a la IL-10 según nuestras predicciones in silico. Por otro lado, en la regulación indirecta se sugiere que la expresión de IL-10 también puede regularse a nivel de señalización. El bloqueo del receptor TLR2 aumenta la expresión de miR-146b-5p, lo que puede provocar la supresión de las proteínas de la vía y, por tanto, la expresión de IL-10.
Se identificaron los miARN inducidos por el probiótico que podrían regular la expresión de IL-10 a diferentes niveles. El receptor tipo peaje 2 suprime la inmunidad contra Candida albicans mediante la inducción de IL-10 y células T reguladoras.
