Este trabajo se realizó en los Laboratorios de Productos Naturales y Alimentos de la Universidad Tecnológica de La Mixteca, bajo la dirección del Dr. La UNESCO en 2010 incluyó esta bebida en la Lista del Patrimonio Cultural Inmaterial de la Humanidad.
INTRODUCCIÓN
ANTECEDENTES
GENERALIDADES DEL PULQUE
- HISTORIA
- IMPORTANCIA NUTRICIONAL Y POTENCIAL PROBIÓTICO
- PRODUCCIÓN DE PULQUE EN MÉXICO
Los autores realizaron una identificación genética mediante la secuenciación del gen 16S rRNA y evaluaron in vitro el potencial probiótico y la actividad antimicrobiana de las BAL aisladas. 14] evaluaron el potencial probiótico in vitro e in vivo de Leuconostoc mesenteroides cepa P45 aislado de pulque de Huitzilac, Morelos.
PROCESO ARTESANAL DE PRODUCCIÓN DE PULQUE
- AGAVE PULQUERO Y PROCESO DE CAPADO
- OBTENCIÓN DE AGUAMIEL
- OBTENCIÓN DEL INÓCULO INICIAL O SEMILLA
- PRODUCCIÓN DE PULQUE
Cuando alcanza la madurez, la planta de maguey comienza su floración para la producción de semillas. Para producir el inóculo o "semilla", se deja fermentar una pequeña cantidad de hidromiel fresco en una tina de aproximadamente 20 litros dedicada únicamente a la producción de semillas.
PRINCIPIOS DE INGENIERÍA DE FERMENTACIONES
- ETAPAS DE CRECIMIENTO MICROBIANO
- PARÁMETROS IMPORTANTES DEL PROCESO
- TIPOS DE PROCESOS DE FERMENTACIÓN
En un proceso de fermentación discontinua (Fig. 2), el medio de cultivo con la carga completa del sustrato inicial (So) se coloca en el biorreactor. Un proceso de fermentación continua (Fig. 3) consiste en un biorreactor con una carga total de sustrato (So), al que se le añade un volumen de inóculo con una determinada concentración celular (Xo).
PROBLEMAS DE LA CALIDAD DEL PULQUE Y ESTRATEGIAS PARA SU
26] realizaron un estudio del comportamiento de algunos patógenos en el proceso de producción de pulpa. Estos resultados se atribuyeron a la competencia de los microorganismos patógenos con la microbiota autóctona presente en el aguamiel y el pulque.
PROCESOS DE FERMENTACIÓN ASÉPTICA
38 La principal desventaja de utilizar procesos térmicos para esterilizar alimentos o bebidas radica en la pérdida de nutrientes o cambios en las características sensoriales de los productos. Por lo tanto, en este proyecto se llevó a cabo la esterilización en frío mediante tecnología de membrana de microfiltración.
FUNDAMENTOS DE LOS PROCEOS DE MEMBRANAS DE MICROFILTRACIÓN
Este tipo de proceso se utiliza para pruebas analíticas a nivel de laboratorio y selectividad de membrana. Uno de los principales problemas en el funcionamiento de las membranas de microfiltración es la reducción progresiva del flujo de permeado a medida que se produce el depósito de partículas en la superficie de la membrana tales como proteínas, sales, complejos macromoleculares, entre otros materiales.
PROCESOS DE FERMENTACIÓN EN EL PULQUE Y SU MICROBIOTA
- FERMENTACIÓN ÁCIDO-LÁCTICA
- FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
- FERMENTACIÓN VISCOSA
Las levaduras son las principales responsables de la producción de etanol en el mosto a partir de compuestos fermentables como glucosa, fructosa y galactosa. Las levaduras que se han identificado en el proceso de producción de pulpa son del género Saccharomyces, tales como: S.
TÉCNICAS DE IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE MICROORGANISMOS Y DE
- MÉTODOS DEPENDIENTES DEL CULTIVO
- MÉTODOS INDEPENDIENTES DEL CULTIVO
Posteriormente se añaden bases de nucleótidos marcadas con fluorocromos correspondientes a las bases de la cadena de ADN que se está secuenciando. Tras secuenciar los fragmentos de ADN, el estudio del electroferograma (cromatograma que indica las bases obtenidas mediante la secuenciación) es el primer paso en el análisis de las secuencias.
ESTADO DEL ARTE
PROCESOS SEMICONTINUOS DE FERMENTACIÓN DE BEBIDAS ALCOHÓLICAS . 49
Actualmente la microfiltración es muy utilizada en la industria vitivinícola para obtener productos de calidad, donde el aspecto más importante es la esterilidad del producto final. Con base en la revisión bibliográfica podemos concluir que a la fecha no existen publicaciones sobre la esterilización en frío del aguamiel para la elaboración de pulque.
DINÁMICA MICROBIANA EN EL PROCESO DE PRODUCCIÓN DEL PULQUE
En el caso de las levaduras, los autores identificaron las especies Kluyveromyces marxianus y Saccharomyces cerevisiae. 60], realizó un estudio sobre los perfiles de las comunidades microbianas durante el proceso de fermentación del pulque.
MARCO CONCEPTUAL DE LA TESIS
JUSTIFICACIÓN
ORIGINALIDAD
OBJETIVOS
- OBJETIVO GENERAL
- OBJETIVOS ESPECÍFICOS
- METAS
Análisis de diversidad microbiana en el pulque inicial mediante la técnica PCR-DGGE y secuenciación de bandas características de ADN. Análisis del proceso discontinuo con sucesivos reemplazos hasta alcanzar el estado cuasi estacionario según los parámetros monitoreados en el Objetivo 5.2. Aislamiento e identificación de microorganismos presentes en el producto final del proceso de fermentación semicontinua del pulque mediante métodos dependientes de cultivo de acuerdo con los objetivos establecidos para el Objetivo Específico 2.
Análisis de la diversidad microbiana en el producto final del proceso de fermentación semicontinua del pulque mediante métodos independientes del cultivo de acuerdo con los objetivos planteados para el objetivo específico 3.
MATERIALES Y MÉTODOS
RECOLECCIÓN DE LA SEMILLA Y DE AGUAMIEL
MICROFILTRACIÓN DEL AGUAMIEL
PRODUCCIÓN DE PULQUE EN UN REACTOR SEMICONTINUO A NIVEL PILOTO . 61
- COLOR
- pH
- ACIDEZ TOTAL
- SÓLIDOS SOLUBLES TOTALES (°BRIX)
- DETERMINACIÓN DEL % DE ALCOHOL (ETANOL)
- SÓLIDOS TOTALES (S.T.)
- AZÚCARES REDUCTORES
Este parámetro se determinó utilizando 10 ml de muestra, en una proporción 1:1 de la muestra con agua destilada. Para calcular la concentración de azúcares en las muestras se utilizó la ecuación de la recta obtenida de la curva de calibración. Finalmente, se determinó la absorbancia de la mezcla de reacción a 540 nm en el espectrofotómetro UV-Vis GENESYSTM 50 (Thermo ScientificTM, EE.UU.).
Para calcular la concentración de azúcares reductores fermentables en ppm de las muestras se utilizó la comparación de la línea recta obtenida de la curva de calibración.
ANÁLISIS SENSORIAL
Los tubos con la mezcla de reacción se colocaron en un baño térmico a temperatura de ebullición durante 5 min, e inmediatamente se llevaron a un baño de agua fría para detener la reacción. Con el fin de describir y cuantificar los parámetros sensoriales del aguamiel a través del proceso de fermentación utilizando como referencia la semilla de pulque, se realizó una prueba de análisis descriptivo comparativo como se muestra en la Fig. 12, en el que los evaluadores asignaron valores negativos o positivos. dependiendo de la referencia, verificar por parte de los evaluadores si el pulque obtenido durante la fermentación en el reactor semicontinuo, utilizando aguamiel estéril como sustrato, es similar al pulque con el que se inoculó el sustrato (semilla de pulque).
CARACTERIZACIÓN DE LA POBLACIÓN MICROBARIA PRESENTE EN EL INÓCULO Y DURANTE EL PROCESO DE ELABORACIÓN DEL.
CARACTERIZACIÓN DE LA POBLACIÓN MICROBIANA PRESENTE EN EL INÓCULO
- MEDIOS DE CULTIVO PARA CONTEO Y AISLAMIENTO DE GRUPOS
- CULTIVO DE MICROORGANISMOS
- CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA Y MICROSCÓPICA DE LAS COLONIAS . 70
- AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS CARACTERÍSTICOS
Luego se realizó la siembra por extensión, utilizando una cantidad de 0,1 mL de la dilución seleccionada en la caja con aproximadamente 15 mL del medio de cultivo correspondiente. La enumeración de diferentes grupos de colonias se realizó para el inóculo inicial y en el producto final de fermentación considerando todos los medios selectivos mencionados en la sección 5.6.1. Por otro lado, en el caso del monitoreo de la dinámica microbiana durante el proceso de fermentación semicontinuo, el recuento total y el recuento de grupos microbianos se realizó únicamente en medios selectivos (MRS, APT y APD).
Se aislaron colonias del inóculo y del producto final de la fermentación semicontinua que mostraron diferentes características morfológicas y microscópicas con base en la clasificación realizada de acuerdo con la Sección 5.6.3.
CARACTERIZACIÓN GENÉTICA MICROBIANA POR MÉTODOS DEPENDIENTES DE
- EXTRACCIÓN DE ADN DE COLONIAS AISLADAS
- ELECTROFORESIS EN GEL DE AGAROSA
- AMPLIFICACIÓN Y PURIFICACIÓN DEL GEN ARNr 16S Y DE LA REGIÓN ITS
- IDENTIFICACIÓN GENÉTICA
- ESPECTROMETRÍA DE MASAS MALDI Biotyper®
Luego, se colocaron 650 µL de la mezcla en la columna de centrifugación DNeasy Mini colocada en un tubo de recolección de 2 ml (suministrado), se centrifugó durante 1 min a 8000 rpm y se descartó el sobrenadante. Luego, se transfirieron 49 µL de la mezcla correspondiente a una reacción a microtubos de PCR y se añadió 1 µL del ADN de estudio. El producto final de la amplificación se verificó en un gel de agarosa al 1% en tampón de electroforesis TBE, visualizándolo en el fotodocumentador Molecular Imager Gel-DocTM XR+.
La composición de la mezcla de reacción para la degradación enzimática se muestra en la Tabla 7.
CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA POR MÉTODOS INDEPENDIENTES DE
- EXTRACCIÓN TOTAL DE ADN
- PCR-DGGE
En el caso del gen 16S rRNA se amplificaron las regiones V3 y V6-V8, ya que son marcadores ampliamente utilizados para caracterizar comunidades bacterianas mediante la técnica PCR-DGGE. La Tabla 8 muestra las condiciones de PCR utilizadas en el presente trabajo para amplificar las regiones V3 y V6-V8 [52,61]. La técnica DGGE se realizó utilizando un gel de poliacrilamida con un gradiente de desnaturalizantes de 40-60% de urea y formamida utilizando tampón TAE 1X (Tris-acetato-EDTA).
Se utilizó un fotodocumentador Molecular Imager Gel-DocTM XR+ System para revelar el gel y se manejó el gel de acrilamida con guantes de nitrilo en todo momento.
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
MICROFILTRACIÓN DE AGUAMIEL
- CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA DEL AGUAMIEL
Sin embargo, la concentración de azúcares totales en las dos muestras de hidromiel corresponde al rango reportado en la NMX-V-022 (6-12 g/100 ml) [21]. En cuanto al porcentaje de sólidos totales, los valores obtenidos en la muestra de vaina de semilla están ligeramente por debajo de los datos de Rocha-Arriaga et al. En el caso de los azúcares fermentables, estos autores obtuvieron valores de 0,5 a 1,2 g/L, los cuales se encuentran dentro del rango de los resultados obtenidos en este trabajo.
Por otro lado, el contenido de azúcar del pulque de semilla es menor al obtenido para las muestras de aguamiel.
CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA Y EFECTO DE LA ULTRACONGELACIÓN 92
- CARACTERIZACIÓN FISICOQUÍMICA
- CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA
- CARACTERIZACIÓN SENSORIAL
Se realizaron análisis fisicoquímicos, microbiológicos y sensoriales cada 24 horas para evaluar la dinámica de la fermentación y se determinó que el reactor alcanzó el estado casi estacionario después de 6 días de fermentación en el caso del primer grupo y 8 días en el caso del primer grupo. ambos. Si bien se puede observar en el Cuadro 14, el producto final de fermentación en el reactor semicontinuo no tiene las mismas características físico-químicas que la pulpa de la semilla, en Se monitoreó la dinámica poblacional de microorganismos presentes durante la fermentación del aguamiel en el sistema semicontinuo de producción de pulque desarrollado en este trabajo.
En el caso del primer reactor, se registró una segunda etapa de crecimiento el día 6, la cual al finalizar la fermentación tuvo alrededor de 9 ciclos logarítmicos de crecimiento, más que el pulque de semilla.
CARACTERIZACIÓN DE LA POBLACIÓN MICROBIANA PRESENTE EN EL INÓCULO
- AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS CARACTERÍSTICOS
- EXTRACCIÓN DE ADN DE COLONIAS AISLADAS
- AMPLIFICACIÓN DEL GEN ARNr 16S Y REGIÓN ITS
- DIGESTIÓN ENZIMÁTICA
- PURIFICACIÓN DEL ADN
- IDENTIFICACIÓN MOLECULAR POR ESPECTROMETRÍA DE MASAS Y
- PCR–DGGE
En la Figura 40 se muestra el gel correspondiente a la amplificación de la región V3 de la bacteria y en la Figura el perfil de bandas DGGE (gradiente de desnaturalización 30-60%) de las muestras de pulque utilizando los cebadores correspondientes a la región D1 del gen. Evaluación digital de los índices de la comunidad microbiana de la región D1. riqueza de especies), H (diversidad de especies) y J (uniformidad de pielou).
Perfil de bandas DGGE (gradiente desnaturalizante 30-60%) de las muestras de pulque utilizando los cebadores correspondientes a la región V6-V8 del gen 16S rRNA.
CONCLUSIONES
Los resultados obtenidos en este trabajo pueden ser utilizados para el desarrollo de un proceso de fermentación a nivel industrial para producir pulpa que mantenga las características beneficiosas del proceso artesanal, como la microbiota autóctona de la semilla de pulka y la preservación de las cualidades originales de aguamieli.
PERSPECTIVAS
25] Brányik T, Vicente AA, Dostálek P, Teixeira JA, Ti panagrepaso ti panagporma ti raman kadagiti agtultuloy a panagpaalsem ti serbesa, Journal of the Institute of Brewing. 27] Gomez-Aldapa C. A., Diaz-Cruz C. A., Villarruel-Lopez A., Torres-Vitela M del R, Rangel-Vargas E, Castro-Rosas J, Asido ken alkohol a panaganus ti Escherichia coli O157:H7 iti pulque, ti gagangay a Mehikano inumen, Internasional a Pagwarnak ti Mikrobiolohia ti Taraon. 37] Escalante A, Rodriguez MA, Martinez A, Lopez-Munguia A, Bolivar F, Gosset G, Panagiladawan ti kinanadumaduma ti bakteria iti Pulque, ti tradisional a Mehikano nga alkoholiko a naalsem nga inumen, a kas naikeddeng babaen ti 16S rDNA a panaganalisar, FEMS Microbiology Letters.
70] Enriquez-Salazar MI, Veana F, Aguilar C. C., de la Garza-Rodríguez I. M., López M. G., Rutiaga-Quiñones O. M., Morlett-Chávez J. A., Rodríguez-Herrera R, Diversidad microbiana ha perfil bioquímico sandia oñembyatýva Agave salmiana A-gui .
APÉNDICES
Curva estándar de glucosa para la cuantificación de azúcares totales por el método
Curva estándar de glucosa para la cuantificación de azúcares reductores por el
Visualización de geles de extracción de ADN genómico de las cepas aisladas
Visualización de geles de amplificación del gen ARNr 16S y región ITS a partir del
143 A.4 Visualización en gel de la amplificación del gen 16S rRNA y la región ITS a partir del ADN genómico de las cepas aisladas.
Visualización de geles de digestión enzimática del gen ARNr 16S y región de las
147 A.6 Visualización de geles de purificación del gen 16S rRNA y región ITS de las cepas aisladas.
Visualización de geles de purificación del gen ARNr 16S y región ITS a partir de las
148 Se presentan los geles de electroforesis del ADN genómico extraído de los aislados del pulque congelado.
Concentración de ADN de las cepas después del proceso de extracción y purificación
Árbol filogenético de las cepas aisladas e identificadas
Visualización de un ejemplo de identificación exitosa por la técnica de
Espectros correspondientes a las cepas no identificadas por MALDI Biotyper®
Visualización de geles de extracciones totales, amplificaciones de los días de
