49 6 cromatogramas RP-HPLC del extracto de leche <3 kDa. fermentado por la cepa Lactococcus lactis NRRL B-50571, antes. Por otro lado, los péptidos que no mostraron diferencias significativas (p>0,05) en la actividad inhibidora de la ECA, antes y después de SGI, fueron analizados mediante RP-HPLC-MS/MS.
INTRODUCCIÓN
Por otro lado, actualmente se sabe que el estrés oxidativo juega un papel importante en la aparición de hipertensión arterial, y que los péptidos bioactivos pueden presentar diversas actividades biológicas, principalmente actividad antihipertensiva y antioxidante (Cruz et al., 2004; Torruco et al. , 2008). Sin embargo, se necesitan estudios para validar el potencial antihipertensivo y antioxidante de secuencias peptídicas específicas, ya que el efecto biológico de estos péptidos depende, entre otras cosas, de su capacidad para alcanzar órganos diana intactos después de la administración oral.
ANTECEDENTES
Hipertensión Arterial
- Sistema Renina Angiotensina Aldosterona (SRAA)
- Enzima Convertidora de Angiotensina (ECA)
En la figura 1 se muestra esquemáticamente el funcionamiento del RAAS, que funciona de la siguiente manera: cuando la presión arterial baja, se libera al torrente sanguíneo renina, una proteasa sintetizada principalmente en los riñones. La ECA es estructuralmente una metalopeptidasa de zinc y funcionalmente una ectoenzima unida a membrana que representa el último paso enzimático en la producción de Ang II a partir de Ang I, y como uno de los principales componentes del SRAA, juega un papel fundamental en la regulación de la sangre. presión en el cuerpo (Acharya et al., 2003).
Control de la Hipertensión Arterial
- Tratamientos Farmacológicos
- Tratamientos no Farmacológicos
9 Una dieta equilibrada que contenga los nutrientes más importantes en las cantidades necesarias es un requisito básico para una buena nutrición y el mantenimiento de la salud. La razón por la que diversos científicos e investigadores prestan más atención a los componentes bioactivos de fuentes naturales que tienen un efecto antihipertensivo en el organismo humano (Baltar et al., 2004), tal es el caso de los péptidos derivados de proteínas alimentarias con actividad antihipertensiva que no tienen efectos negativos para la salud (Takano, 2002), de hecho, se ha demostrado mediante estudios toxicológicos que no hay evidencia de toxicidad en ningún órgano tras la administración oral de altas dosis de péptidos, tanto aguda como a largo plazo (Li et al. , 2005) Cadee et al. 2007), con mayor popularidad para los péptidos derivados de proteínas lácteas que podrían usarse en la producción de alimentos funcionales.
Alimentos Funcionales
10 Por este motivo, la alimentación actualmente sirve no sólo para saciar el hambre y aportar los nutrientes necesarios, sino que también contribuye a la prevención de enfermedades relacionadas con la dieta y a la mejora de la salud tanto física como mental (Menrad et al., 2003). Además, existen estudios epidemiológicos que demuestran que el consumo de leche y productos lácteos está inversamente relacionado con el riesgo de hipertensión, y actualmente también se ha encontrado que algunos productos lácteos tienen actividad antioxidante (Jauhiainen et al., 2005).
Leches Fermentadas Como Alimentos Funcionales
12 arterial (Contreras et al., 2009), lo mismo fue demostrado por Gónzález-Cordova et al., (2010) y Rodríguez-Figueroa (2010), ya que a través de la fermentación de la leche con bacterias ácido lácticas, Lactobacillus y Lactococcus, respectivamente , se demostró que posee actividad inhibidora de la ECA. Además, se ha demostrado que la mayoría de los péptidos bioactivos producidos durante la fermentación de la leche son péptidos bioactivos con actividad antihipertensiva y antioxidante (Nakashima et al., 2002; Fitzgerald y Murray, 2006). Todo esto sugiere que diferentes bacterias ácido lácticas son capaces de producir péptidos bioactivos durante el proceso de fermentación y durante el almacenamiento refrigerado (Phelan et al., 2009).
Péptidos Bioactivos
- Actividad Biológica de los Péptidos bioactivos
- Péptidos antioxidantes
- Péptidos antihipertensivos
- Estrategias Para la Producción de Péptidos Bioactivos
- Hidrólisis con enzimas
- Fermentación
- Relación Estructura-Actividad de los Péptidos Inhibidores de la ECA
- Relación Estructura-Actividad de los Péptidos Antioxidantes
En cuanto a los péptidos antioxidantes, Peng et al., (2009) obtuvieron cuatro fracciones de péptidos con diferentes pesos moleculares a partir de una hidrólisis de la proteína aislada. Algunas investigaciones, como la realizada por Contreras et al., (2009), demostraron que la leche es fermentada por cepas específicas de Lactobacillus helveticus y.
Biodisponibilidad de los Péptidos Antihipertensivos y Antioxidantes
La simulación in vitro de la digestión fisiológica con proteasas gastrointestinales es una herramienta muy útil para evaluar la estabilidad de péptidos frente a enzimas digestivas (Matsui et al., 2002). El estudio de Tavares et al., (2011) muestra algunos de los posibles efectos de la digestión sobre los péptidos activos. 23 En cuanto a la actividad antioxidante, Quiros et al., (2007), obtuvieron 11 péptidos, y de ellos el péptido WSVPQPK, mostró una importante actividad neutralizante del radical ABTS+ (valor TEAC 1.297 µmol equivalentes de Trolox/µmol péptido).
Además, Hernández-Ledesma et al., (2005), concluyeron que el péptido Trp-Tyr-Ser-Leu-Ala-Met-Ala-Ala-Ser-Asp-Ile tiene incluso mayor actividad sobre los radicales libres que el butilato de hidroxianisol (BHA ), un antioxidante sintético. Por tanto, la simulación de la digestión gastrointestinal es una alternativa viable para evaluar no sólo la biodisponibilidad de los péptidos, sino también su forma activa y mecanismo de acción (Miguel et al., 2006).
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
General
Específicos
MATERIALES Y MÉTODOS
- Reactivos y Materiales
- Secuencias de Péptidos
- Determinación de la Pureza de Secuencias Péptidicas por RP-HPLC
- Microorganismo y Condiciones de Propagación
- Inóculo y Fermentación de la Leche
- Obtención de Extractos Acuoso < 3 kDa
- Ensayo in vitro de la Actividad Inhibidora de la ECA del Extracto < 3kDa
- Cuantificación de Proteína del Extracto < 3kDa Adicionado con los Péptidos
- Digestión Gastrointestinal Simulada
- Determinación del Peso Molecular de las Fracciones Peptídicas
- Identificación de Secuencia de Péptidos
- Capacidad Antioxidante Mediante el Ensayo ABTS
- Capacidad Antioxidante Mediante el Ensayo ORAC
- Análisis Estadístico
Los péptidos se resuspendieron por separado con el extracto <3kDa obtenido de la leche fermentada para evaluar la actividad IECA. El flujo de columna utilizado fue de 0,2 µl/min con un volumen de inyección de 1 µl. La actividad antioxidante de los extractos acuosos a los que se les agregaron los diferentes péptidos se determinó según la metodología propuesta por Re et al. 1999), antes y después de la simulación gastrointestinal.
El ensayo consistió en mezclar 20 µL de extractos acuosos antes y después de la simulación gastrointestinal con 120 µL de una solución de fluoresceína 70 nM en un pocillo de una microplaca negra (96 pocillos). Se realizó un análisis t pareado para verificar el efecto sobre la actividad inhibidora de la ECA y la actividad antioxidante antes y después de la simulación gastrointestinal.
RESULTADOS Y DISCUSIONES
Ensayo in vitro de la Actividad Inhibidora de la ECA del Extracto < 3kDa
Por otro lado, se puede observar la presencia de aminoácidos como prolina en las diversas secuencias peptídicas y tripéptido IPP en el péptido 4, a la presencia de estos se puede atribuir el efecto reductor ya que estudios previos han demostrado que los tripéptidos IPP y VPP tienen un potencial para reducir la presión arterial alta (Nakamura et al., 1995). Sin embargo, los péptidos 4 (hphphlsfmaipp), 3 (ypsygl), 6 (ydtqaivq), 11 (navpitptln) y 12 (slpqnippl), también presentaron porcentajes de inhibición superiores al 90%, lo que los posiciona como potenciales inhibidores de la enzima. Los valores bajos de IC50 se traducen en una potente actividad de los IECA, ya que se necesita una concentración muy pequeña de la sustancia inhibidora para reducir la acción enzimática.
Este hallazgo concuerda con lo reportado por Hernández-Ledesma et al. 2002) quienes concluyeron que aunque el extremo N no es el factor determinante, juega un papel importante en la inhibición de la ECA. En el caso de los péptidos 3 (SLPQNIPPL) y 5 (YIPIQYVLS) con valores de IC50 de 0,4401 y 0,1537 mg/mL, respectivamente, que son valores bajos, concuerda con lo reportado por Gómez-Ruiz et al., 2004, como destacan, que la presencia de un residuo de leucina en la posición C-terminal es favorable para la inhibición de la ECA.
Actividad Antioxidante del Extracto < 3kDa Adicionado con los Péptidos
En este sentido, existen estudios de la relación estructura-actividad entre péptidos antioxidantes, y se ha demostrado el papel fundamental de ciertos aminoácidos hidrofóbicos en el desarrollo de esta actividad (Cushman y Cheung demostraron mediante péptidos sintéticos que tanto la tirosina como el triptófano se comportan como donadores de hidrógeno debido al grupo fenólico e indol que contienen, a través de los cuales presentan actividad neutralizadora de radicales libres. En este estudio se utilizaron los péptidos 19 (GYLAVA), 3 (YPSYGL), 6 (YDTQAIVQ) y 16 (YIPIQYVLS), sólo aquellos que contenían tirosina y triptófano en su secuencia y mostraron una actividad antioxidante moderada con valores de TEAC entre 861,56 y 1015,14 µmol equivalentes de Trolox/µmol péptido, por lo que la actividad podría atribuirse a la presencia de estos aminoácidos en los péptidos evaluados en este estudio. Se obtuvieron valores entre 543,27 y 1353,35 µmol/g equivalentes de trolox, siendo los péptidos 12 (SLPQNIPPL) y 13 (QEPVLGPVRGPFPIIV) los que obtuvieron los valores mínimo y máximo, respectivamente.
También se observó que los péptidos 19 (GYLAVA9), 4 (HPPHHLSFMAIPP) y 9 (HIQKEDVPS), cuyos valores equivalentes de trolox fueron y 732,22 µmol/g, respectivamente; fueron los que obtuvieron valores más bajos y no se encontraron diferencias significativas (p>0,05). Capacidad antioxidante por el método ABTS y ORAC del extracto < 3kDa adicionado con los péptidos individuales.
Digestión Gastrointestinal Simulada
- Actividad Inhibidora de la ECA de Péptidos Bioactivos
- Determinación del Perfil de Péptidos por RP-HPLC
- Capacidad Antioxidante de Péptidos Bioactivos
Dado que no se encontraron diferencias significativas (p>0.05) antes y después de la simulación gastrointestinal en los péptidos anteriores, es práctico evaluar este efecto mediante un modelo in vivo, y posteriormente podrían usarse para la producción de alimentos funcionales, ya que permaneció activo durante la digestión gastrointestinal (Lee, 2002). Asimismo, todos los péptidos (Figuras 7B-18B) se escindieron como resultado de la exposición a enzimas gastrointestinales. Cromatogramas RP-HPLC del extracto de leche <3 kDa fermentado por la cepa Lactococcus lactis NRRL B.
El análisis estadístico mostró que los péptidos 10 (TVQVTSTAV), 11 (NAVPIPTTLN), 13 (QEPVLGPVRGPPFIIV), 16 (YIPIQYVLS), 20 (DVENLHLPLPLLL) y 17 (TDDIMCVK) mantuvieron la actividad antioxidante antes y después de la exposición sin diferencias significativas. se observó (p>0,05). De manera similar, el péptido 4 (HPPHHLSFMAIPP), 19 (HIQKEDVPS) y 12 (SLPQNIPPL), con valores equivalentes de trolox de 689,40 µmol/g, también conservaron su actividad antes y después del proceso de digestión in vitro. En general, sólo dos de los péptidos evaluados retuvieron la actividad antioxidante por este método antes y después de ser sometidos al proceso de digestión in vitro, a saber, el péptido 4 (HPPHLSFMAIPP) y 3 (YPSYGL) con valores equivalentes de trolox de 724,64 y 1341,29 µmol. , respectivamente. /g, el cual no mostró diferencias significativas (p>0.05) luego de la simulación gastrointestinal.
Dentro de los resultados obtenidos, se encontró que los péptidos 9 (HIQKEDVPS), 11 (NAVPITPTLN) y 12 (SLPQNIPPL) con valores equivalentes de trolox de 954,01 µmol/g aumentaron la actividad antioxidante después de la simulación gastrointestinal.
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFÍA
New probiotic fermented milk with angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides produced by Bifidobacterium bifidum MF 20/5. Purification and hypotensive activity of canola protein-derived renin and angiotensin-converting enzyme inhibitory peptides. Identification of peptides in traditional and probiotic sheep's milk yogurt with angiotensin I-converting enzyme (ACE) inhibitory activity.
Angiotensin-converting enzyme inhibitory activity of milk fermented by wild and industrial Lactococcus lactis strains. Novel angiotensin I-converting enzyme inhibitory peptides produced in fermented milk by specific wild Lactococcus lactis strains.