Al Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, unidad Mazatlán, por las facilidades y apoyo brindado para culminar la maestría. En términos de producción, las enfermedades infecciosas son la principal causa de pérdidas económicas en la acuicultura debido a la mortalidad animal, los costos de tratamiento y la reducción de la producción.
ANTECEDENTES
Tilapia (Oreochromis niloticus)
- Hábitat y biología
- Distribución geográfica
- Sistemas de producción
- Estanques
- Jaulas flotantes
Los estanques de cría de tilapia deben tener un área entre 500 y 1500 m2 para facilitar la recolección de alevines y la cosecha. El cultivo de tilapia (Oreochromis niloticus) en jaulas flotantes de alta densidad se practica en grandes lagos y represas en varios países, entre ellos China, Indonesia, México, Honduras, Colombia y Brasil.
Microbiota de tilapias vivas
Además, Al-Harbi y Uddin (2005) investigaron la diversidad bacteriana de tilapia nilótica cultivada en agua salobre y encontraron que los géneros dominantes en el tracto gastrointestinal de esta especie en estas condiciones eran Vibrio y Streptococcus. Observaron que las condiciones del agua y los sedimentos afectaban la composición bacteriana de las branquias y el intestino de la tilapia.
Enfermedades bacterianas
- Aeromonas móviles (septicemia)
- Pseudomonas
- Vibriosis
- Estreptococosis
- Estafilococosis
- Micobacteriosis
- Edwardsielosis
- Columnaris
- Piscirikettsiosis
- Otras enfermedades bacterianas
Recientemente, Lara-Flores et al. 2006) informaron el aislamiento de micobacterias en medio Löwenstein-Jensen a partir de la sangre y los riñones de O. Realizaron la detección de genes de virulencia de patógenos potenciales mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y utilizando cebadores y condiciones publicados para aerolisinas/hemolisinas, lipasas extracelulares (lip , lipH3, pla, plc y GCAT); Proteasas y ADNasas (Soler et al., 2002).
Identificación y caracterización de agentes potencialmente patógenos
- Técnicas basadas en características fenotípicas
- Métodos moleculares
- Tecnicas para identificación. Secuenciación
- Técnicas de caracterización basadas en la PCR
Factores de virulencia
Sin embargo, algunos de los factores de virulencia pueden estar codificados por genes de plásmidos o profagos (Wassenaar y Gaastra, 2001). La mayoría de los estudios se han realizado con bacterias patógenas aisladas de peces (Amaro, 1992; Alcaide et al., 1999).
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Objetivos Particulares
METODOLOGÍA
- Obtención de los aislados
- Purificación y preservación de los aislados
- Caracterización fenotípica de los aislados bacterianos
- Métodos microbiológicos convencionales
- Sistema miniaturizado API 20E
- Caracterización genómica de los aislados bacterianos
- Caracterización por rep-PCR
- Identificación molecular
- Estudio de potenciales factores de patogenicidad extracelulares
- Obtención de los productos extracelulares (ECP)
- Determinación de las actividades enzimáticas presentes en los ECP
- Patogenicidad y factores de virulencia
- Preliminares
- Infección experimental en tilapias (O. niloticus) y ECP de cepas
- Infecciones experimentales con células y ECP de la cepa C510m
La visualización del color se realizó con un microscopio óptico (Carl Zeiss, Axiolab drd KT) a 100X. Para realizar la prueba del caldo VP, se preparó el medio Clark and Lubs (7 g de peptona, 5 g de dextrosa, 5 g de fosfato de potasio (K2HPO4), 1000 ml de agua destilada). Se sembró una colonia pura durante 18 a 24 horas de crecimiento en cajas de agar TCBS para determinar su crecimiento y color.
Se sembró una colonia limpia en placas de agar McConkey durante 18 a 24 horas para determinar su crecimiento y color. Después de disolver los ingredientes, se ajustó el pH a 7,5 y se esterilizó el medio en un autoclave a 110 °C durante 15 minutos. La purificación se realizó utilizando el kit de purificación por PCR QIAquick (Qiagen) para eliminar los productos de amplificación residuales.
La concentración de proteínas presentes en PEC se determinó mediante el método de Bradford (1976), utilizando concentraciones crecientes (de 5 a 100 µg/ml) de albúmina sérica bovina (Sigma) para preparar la curva estándar.
RESULTADOS
Caracterización e identificación de los aislados
- Caracterización fenotípica
- Identificación fenotípica
- Caracterización genómica
- Análisis filogenético
- Identificación
La citotoxicidad de la PEC se probó con células HeLa, una línea celular epitelial humana derivada del carcinoma cervical (Toranzo et al. 1983). Cepas de Aeromonas hydrophila (C1b 4m y C5 10m), Aeromonas veronii (C4 3m y C1 11m), Aeromonas jandaei (C4 12m), Soonwooa buanensis (C2b 4m y C7b 4m), Microbacterium paraoxydans (C2 6m) y Vogesella perlucida (C6 ). 11m) hubo destrucción completa de la pared celular en las primeras doce horas después de la infección, mientras que los aislados restantes mostraron solo una destrucción parcial de la pared celular en las primeras doce horas y durante el desarrollo del ensayo y algunos casos en las primeras doce horas. . horas, no se observaron cambios en la monocapa de células (Figura 7). Porque la literatura muestra que la producción cuantitativa y cualitativa de proteasas es importante para determinar la virulencia de una cepa particular (Thune et al., 1986;.
Los cambios causados por PEC, como natación errática y letargo, oscurecimiento de la piel, inflamación del estómago y presencia de líquido sanguinolento, así como sangrado en la piel, fueron similares a los observados con los productos extracelulares de Vibrio anguillarum en trucha arco iris (Lamas et al., 1994). Por su parte, Fouz et al. 1995) observaron síntomas clínicos severos y lesiones histológicas con los productos extracelulares de Photobacterium damselae en las almohadillas plantares (Scophthalmus maximus). Wang et al., (2003) sugirieron que la causa de la citotoxicidad de las especies de Aeromonas y sus productos extracelulares puede ser multifactorial y que los productos (α- y β-hemolisinas, ADNasas, enterotoxinas proteasas y ARNasas) actúan solos o en su totalidad. .
La actividad hemolítica encontrada en células vivas de Aeromonas hydrophila se ha asociado con la producción in vivo de áreas hemorrágicas en desafíos experimentales (Rey et al., 2009).
Estudio de potenciales factores de patogenicidad extracelulares
- Cuantificación de proteínas y determinación de la actividad proteolítica
- Actividades enzimáticas de los PEC
- Sistema de determinación de actividades enzimáticas en placa
- Ensayo de citotoxicidad
- Actividad hemolítica de los PEC
Patogenicidad y factores de virulencia
- Ensayos preliminares
- Infecciones experimentales con PEC en lenguados (Solea vulgaris)
- Infecciones experimentales con células y PEC de la cepa Aeromonas
Sólo dos de las doce cepas probadas con tilapias causaron porcentajes de mortalidad del 100%, la PEC de Aeromonas hydrophila (C5 10m) causó 100% de mortalidad durante las primeras 12 horas. Las infecciones con células bacterianas de la misma cepa también provocaron un 100% de mortalidad entre 12 y 18 horas después de la infección cuando el inóculo inyectado fue de 1,4 x 108 UFC/ml (dosis de 5,6 x 106 UFC/g; Figura 8). Tanto los organismos infectados con células como los inyectados con el PEC mostraron nado errático y letargo, oscurecimiento de la piel, inflamación del estómago y presencia de líquido sanguinolento al momento de abrirlos para análisis bacteriológicos.
La otra cepa que causó 100% de mortalidad fue Pseudomonas mosselii (C4 1m); estas mortalidades se observaron sólo cuando a los organismos se les inyectó PEC. Se logró una mortalidad del 100% durante las primeras doce horas después de la infección con los productos extracelulares (Figura 9). Los organismos infectados con productos extracelulares mostraron oscurecimiento de la piel, natación irregular e inflamación del estómago.
Se encontraron los mismos síntomas en organismos a los que se les inyectaron células bacterianas vivas, excepto que se observaron más tarde que en la PEC.
DISCUSIÓN
Identificación de los aislado vacteriano
Análisis de potenciales factores de virulencia extracelulares
En el caso de los aislados del género Aeromonas donde el nivel de actividad proteolítica fue alto, se observaron resultados positivos en todas las muestras de PEC para las actividades gelatinolítica, ADNasa y lipasa (Tabla 9). Como se mencionó anteriormente, los niveles más altos de actividad proteolítica, así como la actividad proteasa más amplia, se encontraron en las muestras de PEC procedentes de aislados del género Aeromonas. Diversos autores han correlacionado esta actividad con su capacidad para inducir patologías en peces, vinculando dicha patogenicidad a sus productos extracelulares (Austin y Adams, 1996; González et al., 2001).
Los productos extracelulares pueden contener diferentes factores de virulencia (proteasas, ADNasas, elastasas, lectinasas, amilasas, gelatinasas, hemolisinas, lipasas) que pueden modificar la membrana plasmática del huésped y desempeñar un papel importante en el desarrollo de enfermedades, ya sea en humanos o en peces (Howard et al., 1996; Pemberton et al., 1997; Santos et al., 1999; Murray et al., 1999; Soler et al., 2002). Estas enzimas son útiles en la identificación de la bacteria, en sus funciones fisiológicas y muchas veces son consideradas como factores asociados con la virulencia, en este y otros géneros bacterianos (Pemberton et al., 1997). En otro estudio, Wang et al. 1998) señalan que Photobacterium damselae PEC induce cambios citotóxicos en líneas celulares epiteliales de peces.
Hay estudios que muestran que las bacterias del género Pseudomonas producen una variedad de proteínas extracelulares in vitro (La Peyre et al., 1995; Faisal et al., 1999), incluidas proteasas que promueven la diseminación dentro del huésped y la diseminación dentro del huésped facilitador. la proliferación de patógenos (La Peyre et al. 1996).
Infección experimental en tilapias (O. niloticus) y PEC de cepas
Los síntomas fueron similares a los descritos en truchas arco iris infectadas naturalmente con Aeromonas hydrophila (Aydin et al., 1997) y también en bagres infectados experimentalmente con una cepa diferente por A. Rahman et al., (2002) aislaron Aeromonas veronni de peces como como .ej. ; Clarias gariepinus, Puntius gonionotus, Labeo rohita, Catla catla y Channa striatus de diferentes granjas en Bangladesh. Otra cepa que en el presente trabajo no causó mortalidad pero que se reporta como patógena es Edawardsiella Tarda que causa Edwardsielosis que causa mortalidad en especies de peces silvestres y de cultivo (Kusuda y Salati, 1993; Thune et al., 1993; Rashid et al. , 1994).
Factores de virulencia como la adhesión e invasión de células epiteliales (Strauss et al, 1997; Ling et al, 2000), la producción de hemolisina y otras toxinas (Janda et al., 1991a; Suprapto et al, 1996) y la resistencia sérica (Janda et al. . , 1991b) han sido implicados en la patogénesis de Edwardsiella Tarda. Por otro lado, Microbacterium paraoxydans fue aislado por primera vez de sangre humana (Laffineur et al., 2003; Gneiding et al., 2008) y del hígado de ratones de laboratorio (Buczolits et al., 2008), y hasta la fecha no. Se han reportado casos de infecciones en peces como el de este estudio. Soonwooa buanensis fue aislada del agua del Mar Amarillo en Corea y pertenece a la familia Flavobacteriaceae (Young et al., 2009).
Se informó de un aislamiento de Vogesella perlucida en agua de pozo en el condado de Tainan, Taiwán (Chou et al., 2008); no hay información de que hayan sido patógenos para los peces.
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
LITERATURA CITADA
Neurotoxic nga epekto ti supernatant ti Vibrio alginolyticus ken Vibrio anguillarum iti dua a kita ti ikan ken maysa a PC12 cell line. Thesis a naiparang iti paset a pannakatungpal dagiti kasapulan para iti degree a "Bachelor of Science in Bioanalysis", Unibersidad ti Carabobo, Fakultad ti Siensia ti Salun-at, Eskuelaan ti Bioanalisa, Maracay, Venezuela. Kaadda ti makapapatay a protease kadagiti ekstraselular a produkto dagiti Vibrio splendidus-Vibrio lentus-a mainaig a kita.
In vitro and in vivo studies of the Yrp 1 protease of Yersinia ruckeri and its role in protective immunity against enteric rubella disease of salmonids. Characterization of Vibrio strains isolated from turbot (Scophthalms maximus) culture by phenotypic analysis, ribotyping and 16S rRNA gene sequence comparison. Phylogenetic analysis and assessment of the genera Vibrio, Photobacterium, Aeromonas and Plesiomonas inferred from small subunit rRNA sequences.
Report of the ad hoc committee for the reevaluation of the species definition in bacteriology. Hemagglutination, hemolytic and cytotoxic activities of Vibrio anguillarum and related vibrios isolated from striped bass on the Atlantic coast. Detection and characterization of the hemolysin genes in Aeromonas hydrophila and Aeromonas sobria by multiplex PCR.