Para la reproducción parcial o total de la tesis con fines académicos se deberá obtener la autorización escrita del Director General del CIAD. Durante la replicación del material genético, la PCNA se une a la ADN polimerasa, uniéndola a la cadena de ADN y aumentando así la procesividad de la enzima. La estructura consta de un homotrímero en forma de anillo y mantiene la disposición típica de la mayoría de los PCNA eucariotas.
Con la estructura cristalográfica creada se realizó un modelo donde se puede observar una interacción factible de LvPCNA con el campo PIP de la ADN polimerasa viral.
INTRODUCCIÓN
Otro virus que codifica una ADN polimerasa es el virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV) (Chen et al., 2002; De-la-Re-Vega et al., 2011a), el cual es de importancia mundial por ser un patógeno que afecta a la industria del camarón. El genoma viral codifica una ADN polimerasa pero no codifica ninguna proteína accesoria a la replicación. Según ensayos in vitro, el ADN viral por sí solo tiene baja actividad, lo que sugiere que utiliza factores de replicación del huésped, el camarón blanco Litopenaeus vannamei (Lv) (De-la-Re-Vega et al., 2011a).
3 infección de crustáceos con WSSV y se ha sugerido que es posible que el patógeno utilice PCNA del huésped (De-la-Re-Vega et al., 2011b).
ANTECEDENTES
PCNA en los Procesos Celulares
- Bioquímica del Replisoma y la Participación del PCNA
- Importancia del PCNA en la Reparación del ADN
- Reparación mediada por escisión de nucleótidos
- Reparación mediada por escisión de bases
- Reparación de ADN en bases mal apareadas
- PCNA en la síntesis translesional
- Control del Ciclo Celular
- Remodelación de Cromatina
- Vías Apoptóticas
Se informa que en la cadena continua participa una ADN polimerasa diferente a la presente en la síntesis de la cadena discontinua (probablemente pol ) (Johnson y O'Donnell, 2005; Moldovan et al., 2007). El cargador de PCNA (RFC) se muestra en violeta y está unido a las dos ADN polimerasas, el complejo MCM y una molécula de PCNA abierta (rosa) lista para colocarse en la cadena de ADN. La investigación de mutaciones en la región de unión de PCNA conduce a una deficiencia en el sistema de reparación NER (Gary et al., 1997) (Figura 2).
Además de RAD6 y RAD18, la ubiquitina ligasa RAD5 también participa en la poliubiquitinación, que recluta las proteínas ubc13 y Mms2 (Moldovan et al., 2007).
Estructura de PCNA
- PCNA Posee una Estructura muy Conservada
- Casos Especiales de Estructura de PCNA
Aunque muchos de estos procesos no están del todo claros, lo cierto es que la PCNA participa en su regulación (Moldovan et al., 2007). Estas características estructurales de la abrazadera hacen que se observe como un pseudohexámero, comparable al PCNA de eucariotas (Figura 6) (Kong et al., 1992). En ambos casos, la molécula se observa como un pseudohexámero y forma un anillo (tomado de Carrasco-Miranda et al., 2014).
La unión de los monómeros 1 y 2 es muy fuerte y el ensamblaje de la tercera subunidad para cerrar el bucle es mucho más débil, como se observa en ssoPCNA (Dionne et al., 2003).
Interacción PCNA-Proteínas
- Secuencia APIM como Sitio Alternativo de Unión a PCNA
La unión de la caja PIP a esta región se ha demostrado en varias estructuras cristalográficas; la superposición de algunas de estas estructuras se muestra en la Figura 7. Péptidos pertenecientes a la caja PIP de DNA pol delta (rojo, PDB 1U76), FEN1 (blanco, PDB 1UL1), DNA pol kappa (naranja, PDB 2ZVL) y RNase H (azul, PDB 3P87) se unen al mismo sitio en PCNA (verde) y adoptan estructuras muy similares, formando una hélice corta. Se cocristalizaron 24 hPCNA con péptidos pertenecientes a la caja PIP de cada proteína (Bruning y Shamoo, 2004).
El residuo hidrofóbico de la caja PIP de p21 es Met, cuya cadena lateral llena la cavidad hidrofóbica mejor que la Ile de pol o la Leu en FEN 1. Sin embargo, las polimerasas de translesión poseen una caja PIP atípica donde la principal diferencia es el residuo inicial Gin, que en pol es Met, mientras que en pol y pol es Lys. Este cambio hace que la caja PIP no se monte de manera tan compacta dentro de la cavidad hidrofóbica de PCNA, formando un enlace más débil que el observado para pol , FEN 1 o p21.
Otra característica es que todos tienen un residuo ácido (Asp) en la posición 5 de la caja PIP, que aparentemente es importante para la unión con PCNA. Además del sitio de interacción PCNA, TLS tiene un sitio de unión de ubiquitina cerca de la caja PIP. La mayoría de las proteínas que interactúan con PCNA lo hacen a través de la caja PIP; Sin embargo, Gilljam y colaboradores (2009) demostraron que algunas proteínas tienen secuencias de unión a PCNA atípicas, a las que llamaron secuencias APIM (por sus siglas en inglés: AlkB homologue 2 PCNA-interacting motive).
El homólogo de la dimetilasa oxidativa humana ALKB 2 (HABH2) participa en el sistema de reparación de bases del ADN (BER), interactuando directamente con PCNA a pesar de no poseer una caja PIP (Gilljam et al., 2009). La secuencia APIM se encontró en más de 200 proteínas celulares nucleares, de las cuales nueve proteínas también contienen una caja PIP.
Los Virus Necesitan de PCNA para su Replicación
Esto indica que la alta sensibilidad a agentes genotóxicos no se debe sólo a la inhibición de HABH2, sino también a otras proteínas que participan en el mantenimiento del genoma (Gilljam et al., 2009). Estos estudios demostraron que esta nueva secuencia consenso para la unión de PCNA es funcional y está ampliamente distribuida en las proteínas de mantenimiento del genoma (Gilljam et al., 2009). 27 Otro virus que codifica su propia ADN polimerasa pero que no tiene un factor de procesividad identificado es el virus del síndrome de la mancha blanca (WSSV).
Este es un virus que afecta a los crustáceos, pero es importante a nivel mundial porque es un problema grave en la industria camaronera. WSSV causa pérdidas económicas multimillonarias en el cultivo de camarón, su mortalidad es del 100% en periodos muy cortos (7 a 10 días después de la infección), y hasta el día de hoy no hay forma de controlarlo (Escobedo-Bonilla et al., 2008; Bustillo-Ruiz et al., 2009; Sánchez-Paz, 2010). Se conoce el genoma completo del virus y, mediante análisis bioinformáticos, se informó que codifica una ADN polimerasa (Chen et al., 2002).
La alineación de aminoácidos de ORF 514 muestra que la enzima tiene una caja PIP, que se cree que se une a PCNA, probablemente del huésped (De-la-Re-Vega et al., 2011a). De-la-Re-Vega y colegas (2011) informaron sobre la secuencia de aminoácidos de PCNA del camarón Litopenaeus vannamei, que está altamente conservada con respecto a la alineación reportada entre vertebrados e invertebrados. El modelo estructural teórico muestra la estructura anular típica de PCNA con un centro positivo.
La expresión de PCNA se evaluó mediante RT-qPCR en organismos infectados con WSSV, donde los niveles de expresión de PCNA permanecieron estables durante las 48 h de infección evaluadas, lo que sugiere que la producción de PCNA es constante mientras el virus se replica (Dela-Re-Vega et al., 2011b). . Para dilucidar mejor cómo interactúan el WSSV y su huésped, es necesario realizar estudios estructurales de la molécula PCNA del camarón.
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
Objetivo General
Objetivos Específicos
MATERIALES Y MÉTODOS
Cristalización y Resolución de la Estructura Tridimensional
- Obtención de Cristales de LvPCNA
- Resolución de la Estructura de LvPCNA
34;Structure and biochemical characterization of proliferating cellular nuclear antigen from a parasitic protozoan." Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography. 34;Molecular modeling and expression of Litopenaeus vannamei proliferating cell nuclear antigen (PCNA) following white spot syndrome virus shrimp infection. " Results in Immunology . 34;Structure of an archaeal PCNA1–PCNA2–FEN1 complex: elucidation of PCNA subunit and client enzyme specificity.
34;Structural basis for novel interactions between human translesion synthesis polymerases and proliferating cell nuclear antigen." Journal of Biological Chemistry. 34;Physical and functional interaction of human nuclear uracil-DNA glycosylase with proliferating cell nuclear antigen." 34; Crystal structure of an archaeal DNA sliding clamp: proliferating cell nuclear antigen from Pyrococcus furiosus.” Protein Science.
34;A flexible interface between DNA ligase and PCNA supports conformational switching and efficient DNA binding." Molecular Cell. 34;Cell cycle-regulated nuclear antigen of proliferating cells is required for SV40 DNA replication in vitro". 34; Molecular Mechanisms of Mammalian DNA Repair and DNA Damage Checkpoints.” Annual Review of Biochemistry.
34;Arabidopsis thaliana proliferating cell nuclear antigen has adskillige potentielle sumoyleringssteder." Journal of Experimental Botany: in press. 34;Crystal structures of the Arabidopsis thaliana proliferating cell nuclear antigen 1 and 2 proteins complexed with the human p21 C―terminal segment. " Protein Videnskab.
Modelación de la Caja PIP de WSSV DNA Polimerasa
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
- Sobreexpresión y Purificación de LvPCNA
- Cristalización y Difracción de LvPCNA
- Determinación de la Estructura Cristalográfica de LvPCNA
- Modelo del Complejo LvPCNA-caja PIP de WSSV ADN pol
El carril 2 muestra el extracto crudo antes de la inducción, en esta etapa todavía no hay sobreexpresión de LvPCNA. El aumento de la intensidad de las bandas corresponde al aumento de la cantidad de LvPCNA sobreexpresada según el tiempo posterior a la inducción. La cromatografía de filtración en gel reveló que el peso molecular de la proteína recombinante es de 110 kDa y considerando que cada monómero tiene un peso estimado de 32 kDa, se confirmó que la estructura cuaternaria está compuesta por un homotrímero (Figura 9).
En el cuadro de la izquierda se muestra la curva estándar con diferentes pesos moleculares correspondientes a tiroglobulina (670 kDa), globulina (158 kDa), ovoalbúmina (44 kDa) y mioglobulina (17 kDa). La proteína pura en un gel SDS-PAGE al 12 % teñido con azul de Coomasie se muestra en el cuadro de la derecha (Carrasco-Miranda et al., 2012). La densidad electrónica en el modelo inicial muestra claramente la posición de la columna vertebral de la proteína, según la estructura de las hélices y las láminas (Figura 11).
Debido a la naturaleza de la proteína (homotrímero), se tuvo en cuenta la simetría no cristalográfica (NCS) en los parámetros de refinamiento, con las regiones definidas manualmente, considerando cada subunidad como una unidad de simetría. El lado izquierdo de la tabla describe los principales parámetros a tener en cuenta al refinar la estructura cristalográfica. La estructura general del LvPCNA es congruente con la estructura de la mayoría de los PCNA informados con una matriz IDCL.
Este resultado asegura que los resultados del modelado sean consistentes y otorga mayor confiabilidad al análisis. La figura muestra cuatro representaciones diferentes del modelo de unión de LvPCNA con el péptido perteneciente a la caja PIP de la ADN polimerasa de WSSV.
CONCLUSIONES
34;The DNA repair endonuclease XPG binds to proliferating cell nuclear antigen (PCNA) and shares sequence elements with the PCNA-binding regions of FEN-1 and cyclin-dependent kinase inhibitor p21." Journal of Biological Chemistry. 34;Spatial subunit distribution and in vitro functions of the new trimeric PCNA complex from < i> Sulfolobus tokodaii." Biochemical and Biophysical Research Communication. 34; Mechanism of Replication Machinery as Revealed by the DNA Ligase-PCNA-DNA Complex Architecture.” Proceedings of the National Academy of Sciences.
34;Building a replisome from interacting fragments: sliding clamp complexed to a peptide from DNA polymerase and a polymerase editing complex." Cell. 34;Processivity factor for DNA polymerase and its expanding role in normal and translesion DNA synthesis." Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and proteomics. 34; The crystal structure of an unusual processivity factor, herpes simplex virus UL42, bound to the C terminus of its cognate polymerase." Molecular Cell 5(2):.
ANEXOS
Crystallization and X-ray diffraction studies of
Crystal structure of the shrimp Proliferating Cell
Mutations in NPHS2 (podocin) in Mexican children with