Expresión relativa del gen que codifica la clase GST-tau en mangos control del cultivar 'Ataulfo' durante el almacenamiento poscosecha. Expresión relativa del gen que codifica GST clase phi en mangos control del cultivar 'Ataulfo' durante el almacenamiento poscosecha. Expresión relativa del gen que codifica la clase GST-tau en mangos sometidos a tratamiento hidrotermal del cultivar 'Ataulfo'.
Expresión relativa del gen que codifica GST clase phi en mangos sometidos a tratamiento hidrotermal de la variedad 'Ataulfo' durante la formación de estrías. Expresión relativa del gen que codifica GST clase phi en mangos control y sometidos a tratamiento hidrotermal de la variedad 'Ataulfo' durante el almacenamiento poscosecha. Expresión relativa del gen que codifica la clase GST-tau en mangos control y sometidos a tratamiento hidrotermal de la variedad 'Ataulfo' durante el almacenamiento poscosecha.
Para medir la actividad total de GST, se obtuvo un extracto enzimático de las mismas muestras y se midió la actividad de GST utilizando GSH y CDNB como sustratos.
INTRODUCCIÓN
Los frutos de mango destinados a la exportación requieren un tratamiento térmico contra larvas de insectos (Kim et al., 2007). La enzima glutatión-S-transferasa (GST) en las plantas es una enzima implicada en la detoxificación y transporte de compuestos xenobióticos y endógenos, tanto fuera de la célula como en determinados orgánulos (Dixon et al., 2009; Kumar et al., 2012 ; Mohsenzadeh et al., 2011). Estas clases están involucradas principalmente en el metabolismo de los xenobióticos, por lo que se asocian con una alta tolerancia al estrés provocado por la presencia de herbicidas (Liu et al., 2013).
Además de su función desintoxicante, una gran cantidad de phi- y tau-GST tienen la capacidad de catalizar la reducción de hidroperóxidos, ayudando a contrarrestar los efectos del estrés oxidativo (Dixon y Edwards, 2010; Dixon et al., 2009; Dixon et al...., 2010). Además, su expresión también se estimulaba en presencia de moléculas relacionadas con el estrés oxidativo, como el peróxido de hidrógeno (H2O2) y los aldehídos insaturados (derivados de la peroxidación lipídica) (Fujita y Hossain, 2003; Liu et al., 2013).
ANTECEDENTES
- El Mango: Fruto de Importancia Económica
- Mango cv. ‘Ataulfo’
- El Mango y su Proceso de Maduración
- Cambios en la Textura y Contenido de Azúcares
- Características Organolépticas: Color, Olor y Acidez
- Compuestos Antioxidantes y Fenólicos
- Tratamiento Térmico en Frutos
- Respuesta Fisiológica de los Frutos al Tratamiento con Calor
- Sistemas Enzimáticos de Defensa
- Glutatión S-Transferasa en Plantas
- Función y Características
- GSTs en Frutos
- Estudios de Expresión Génica
La alta capacidad antioxidante del mango de Ataulfo se asoció con un alto contenido de ácidos fenólicos (clorogénico, gálico, protocatequico y vainílico) (Palafox-Carlos et al., 2012a). Los sólidos insolubles en alcohol y el almidón aumentan durante el crecimiento y maduración del mango (Tharanathan et al., 2006). La degradación de la clorofila ocurre fuertemente en la cáscara, pero su presencia en la pulpa se vuelve insignificante cuando la fruta alcanza la madurez comercial (Tharanathan et al., 2006).
En cuanto a los carotenoides totales y β-caroteno, estos aumentan gradualmente a medida que los frutos se acercan a la madurez fisiológica y comercial (Tharanathan et al., 2006). Los frutos rojos y amarillos tienen una alta actividad de fenilalanina amonio liasa (PAL) (Kanyarat et al., 2010). También se ha reportado la presencia de ácidos oxálico, succínico, pirúvico, adípico, galacturónico, glucurónico y múcico (Tharanathan et al., 2006).
En la variedad 'Uba' la pulpa registra una concentración de compuestos fenólicos 4,6 y 7,3 veces menor que en la semilla y la cáscara, respectivamente (Ribeiro et al., 2008). Durante la maduración del mango, los compuestos fenólicos generalmente sufren una disminución tanto en su actividad antioxidante como en su contenido (Maciel et al., 2011). Los sistemas antioxidantes involucrados en la resistencia al estrés en las plantas involucran las enzimas: ascorbato peroxidasa (APX), catalasa (CAT), deshidroascrobat reductasa (DHAR), ferredoxina (Fd), glutatión reductasa (GR), monodehidroascrobat reductasa (MDHAR), glutatión peroxidasa ( GPOX) y superóxido dismutasa (SOD) (Wahid et al., 2007).
En algunos miembros de la familia GST (clases lambda y DHAR), esta serina es reemplazada por cisteína, que promueve reacciones de intercambio de disulfuro entre moléculas de glutatión (GSH) en lugar de formar un complejo conjugado con S que funciona en monómero (Dixon et. al. , 2010). DHAR, se observaron cambios en el metabolismo antioxidante y una mejora de la tolerancia al estrés abiótico (Le Martret et al., 2011). Los estudios de localización de tejidos encontraron que los mismos 4 genes anteriores también se expresaban en la fruta (Wang et al., 2013).
En el chile (Capsicum annuum) y la vid (Vitis vinifera) se ha encontrado evidencia que respalda la participación de las clases GST phi y tau en la ligadura y transporte vacuolar de flavonoides como las antocianinas, e incluso se ha descubierto que algunos genes GST- muestran un perfil transcripcional similar a los genes de la ruta de biosíntesis de flavonoides (PAL, CHS, DFR y UFGT) (Aza et al., 2013; Castellarin et al., 2007; Conn et al., 2008; Kitamura et al., 2012 ). El genoma del arroz tiene 79 genes correspondientes a GST con duplicaciones en tándem (Jain et al., 2010).
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
Objetivo General
Objetivos Específicos
MATERIALES Y METODOS
Obtención y Tratamiento Previo de la Muestra
Perfil de Expresión de los Genes de GST
- Extracción de ARN total
- Eliminación de ADN genómico
- Síntesis de ADNc total
- qPCR y Evaluación de Expresión de GST
Luego, se agregaron 100 µl de una mezcla 25:24:1 de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico para eliminar la proteína y se centrifugó a 12.000 x g durante 6 min a 4 ºC. La mezcla de reacción consistió en 6 µl de Go taq Green Master Mix 2X (Promega) y 0,5 µl de cada uno de los cebadores GAPDH sentido y antisentido (10 µl), que se hibridan con una región del gen GAPDH del mango. Las condiciones de amplificación fueron las siguientes: una fase inicial de desnaturalización (94 ºC durante 5 minutos), luego seguida de 35 ciclos que consistieron en desnaturalización (94 ºC durante 60 segundos), luego alineación (55 ºC durante 30 segundos) y luego una extensión ( 72 ºC durante 60 segundos) y finalizó con una extensión final a 72 ºC durante 5 minutos.
Para la síntesis de ADNc se utilizaron 5 g de ARN total previamente extraído y libre de ADN genómico, se utilizó el sistema comercial SuperScript™ III First-Strand Synthesis System para RT-PCR (Invitrogen) según instrucciones del proveedor. Este protocolo consta de una fase de desnaturalización y adaptación a 65 ºC durante 5 minutos, de una mezcla que contiene el ARN templado, un cebador (dT-oligo, cebador específico de gen o cebador aleatorio) y los dNTPs, tras lo cual la mezcla se coloca sobre hielo durante al menos un minuto. Para la síntesis de la cadena única de ADN se utilizó un cebador oligo (dT) más 10 μL de la mezcla de reacción para la síntesis de ADNc y la reacción se incubó a 50 ºC durante 50 minutos.
Para verificar la síntesis de ADNc, la amplificación por PCR se realizó con las mismas condiciones que las utilizadas para verificar la eliminación de ADN genómico, con la única diferencia de que el hibridación fue de 1 L de una dilución 1:10 del producto de síntesis de ADNc. Los productos de la PCR se sometieron a electroforesis en gel de agarosa al 1% usando tampón TAE a 80 voltios durante 45 minutos y se observaron mediante tinción con Gel Red (Biotium). En la evaluación de la expresión mediante qPCR se utilizaron cebadores específicos (Tabla 1) para las secuencias GST phi y tau a evaluar, los cuales se diseñaron con base en un análisis de secuencia (ClustalW2) (Larkin et al., 2007), donde el nucleótido Se alinearon secuencias de GST phi y tau para seleccionar regiones no conservadas entre ambas secuencias y así obtener productos de amplificación específicos para cada gen.
La mezcla de reacción contenía 4 ng de ADNc como plantilla y 1 µl de cada uno de los cebadores sentido y antisentido específicos (5 µM) para cada clase a evaluar (Tabla 1). La curva estándar se trazó calculando el Log10 de la concentración de ADNc utilizada en cada dilución frente a los valores de Ct obtenidos (número de ciclos). El valor Ct indica el ciclo de PCR en el que la fluorescencia generada supera el umbral o punto de cruce del producto amplificado.
Determinación de Actividad Enzimática GST Total
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
- Análisis de Secuencias y Diseño de Iniciadores
- Obtención de ADNc
- Aislamiento y Evaluación de la Integridad del ARN Total
- Evaluación y Síntesis de ADNc
- Evaluación y Análisis de la Expresión Relativa de GST phi y tau de Mango
- Efecto del Almacenamiento Poscosecha Sobre la Expresión Génica de GST
- Efecto del Tratamiento Hidrotérmico Sobre la Expresión Génica de GST phi y
- Evaluación del Efecto del Tratamiento Hidrotérmico Sobre la Actividad GST
Un paso crucial en la evaluación de la expresión génica mediante PCR cuantitativa es la calidad del ARN que se utilizará para la síntesis de ADNc. Expresión relativa del gen que codifica la clase GST-tau en mangos sometidos a tratamiento hidrotermal de la variedad 'Ataulfo' durante el almacenamiento poscosecha. Expresión relativa del gen que codifica GST clase phi en mangos sometidos a tratamiento hidrotermal de la variedad 'Ataulfo' durante el almacenamiento poscosecha.
Los GST phi y tau del mango 'Ataulfo' se expresan principalmente, y estadísticamente diferentes, en mangos que han sido tratados hidrotermalmente. Esto es consistente con la expresión resultante en frutos de mango 'Ataulfo' del día 1 de almacenamiento poscosecha, donde el GST phi fue estimulado 8 veces más en comparación con el control. El compuesto malonaldehído, producto de la peroxidación lipídica, se ha encontrado luego del tratamiento hidrotermal en mangos de la variedad 'Keiit', desde la etapa inicial, y aumenta significativamente días después (durante el almacenamiento poscosecha) (Djioua et al., 2009) . .
Analizar el efecto del tratamiento hidrotermal sobre la actividad total de GST durante el almacenamiento poscosecha de mango cv. La actividad transferasa de las GST de mango 'Ataulfo' se midió utilizando GSH y CDNB como sustratos. Actividad total de GST de mangos control y tratados hidrotermalmente de la variedad 'Ataulfo' durante el almacenamiento poscosecha.
En los mangos muestreados los días 1, 3 y 5, la pulpa de mango contenía más fibra debido a la inmadurez, lo que afectó el rendimiento de extracción. En cuanto al efecto del tratamiento hidrotermal sobre la actividad GST del fruto de los días en que se pudo detectar, se puede excluir el efecto de la madurez sobre los valores obtenidos, ya que las mediciones fueron en el mismo estado fisiológico (fruto testigo y tratado). ). El aumento de actividad en mangos sometidos a tratamiento hidrotermal probablemente provoca un efecto protector a nivel celular.
El comportamiento de la actividad de GST durante el almacenamiento poscosecha, en primera instancia, no parece concordar con la expresión génica de las GST phi y tau evaluadas. Aunque las GST phi y tau del mango 'Ataulfo' evaluadas en este trabajo, la.
CONCLUSIÓN
Glutathione transferase supergene family in tomato: Salt stress-regulated expression of representative genes from different GST classes in plants primed with salicylic acid. Differential expression of glycine receptor subunit messenger RNA in rats after spinal cord injury. Expression of glutathione-S-transferase and its role in plant growth and development in vivo and shoot morphogenesis in vitro.
An ethylene-responsive enhancer element is involved in the senescence-related expression of the carnation glutathione-S-transferase (GST1) gene. A simple and efficient protocol for isolation of functional RNA from plant tissues rich in secondary metabolites. Differential expression of rice lambda class GST gene family members during plant growth, development and in response to stress conditions.
Functional divergence of the glutathione S-transferase supergene family in Physcomitrella patens reveals complex patterns of large gene family evolution in land plants. Levels of ß-carotene, ascorbic acid and total phenolics in the pulp of five commercial varieties of mango (Mangifera indica L.). Cloning of a DNA-binding protein that interacts with the ethylene-responsive enhancer element of the carnation GST1 gene.
Effect of ripeness stage of mango (Mangifera indica L., cv. Ataulfo) fruits on physiological parameters and antioxidant activity. Versatile and efficient RNA extraction protocol for grape seed tissues suitable for next-generation RNA sequencing. The Arabidopsis glutathione transferase gene family exhibits complex stress regulation, and co-silencing of multiple genes results in altered metabolic sensitivity to oxidative stress.