Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C.
EVALUACIÓN DE UN SISTEMA CERRADO PARA EL CULTIVO DE CAMARÓN BLANCO Litopenaeus
vannamei
POR:
CLAUDIA LIZETH LARA ESPINOZA
TESIS APROBADA POR LA:
COORDINACIÓN DE CIENCIA DE LOS ALIMENTOS Como requisito parcial para obtener el grado de
MAESTRÍA EN CIENCIAS
Hermosillo, Sonora Septiembre de 2012
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AGRADECIMIENTOS
Al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, por haberme brindado el apoyo económico para realizar mis estudios de posgrado.
Al Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A.C. por abrirme las puertas y darme la oportunidad de crecer profesionalmente y de ampliar mis conocimientos.
A la M.C. María del Carmen Bermúdez Almada por recibirme con los brazos abiertos y darme la oportunidad de formar parte de este proyecto y darme siempre su apoyo y disponibilidad.
A la M.C. Angelica Espinosa Plascencia, por ser un gran modelo a seguir que siempre estuvo conmigo en las buenas y en las malas, por darme siempre el apoyo y la seguridad de que todo iba a salir bien y a tiempo, por todos sus comentarios, observaciones y por enseñarme y capacitarme durante la realización del estudio.
A la Granja Acuícola La Borbolla, especialmente al Ing. César Eduardo Patiño Patiño, al Biol. Adolfo Pérez Álvarez y a los Técnicos Juan Carlos Gastélum Domínguez, Luis Elguezabal y Ángel Palomares por todo el apoyo brindado y por todos los conocimientos aportados durante mi estancia en la granja. Gracias a ustedes fue más amena mi estancia. También agradezco a la Sra. Guadalupe Leal Noriega por consentirnos con las deliciosas comidas que nos preparaba y por ser una gran persona.
A mis asesoras las Doctoras Luz Vázquez Moreno y Evelia Acedo Félix por sus atinadas observaciones y sugerencias que enriquecieron este trabajo.
A mi compañero y amigo Edgar Noris Rodríguez, quien me brindo incondicionalmente todo su apoyo, tanto en el desarrollo de esta investigación en el Laboratorio de Análisis Biológicos como en nuestra estancia en la granja camaronícola. Amigo gracias!
Al Laboratorio de Biología Molecular de Plantas, en especial a la Dra.
Marisela Rivera Domínguez y a la Q.B. Karen Rosalinda Astorga Cienfuegos, por el apoyo técnico recibido y por compartir conmigo su experiencia en técnicas moleculares, que fue una parte muy importante de este trabajo, así como por la disposición que siempre me brindaron para utilizar el equipo,
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reactivos y espacio en el laboratorio. Muchas gracias, por toda su ayuda y paciencia.
Al Laboratorio de Biotecnología Marina en especial al Dr. Francisco Vargas Albores por proporcionarnos algunos de los reactivos utilizados en esta investigación y muy especialmente al cDr. Enrique Villalpando Canchola, por su amable disposición y todas las atenciones recibidas durante el desarrollo de una parte de la tesis, permitiéndome utilizar el equipo necesario para llevar a buen termino este trabajo. También quiero agradecer el apoyo incondicional de mi compañera y amiga M.C. Fabiola Valenzuela González, que fue de gran ayuda. Gracias por todos tus consejos y conocimientos compartidos conmigo.
A la Dra. Lorena Olivia Noriega Orozco, por apoyarnos con la donación de las cepas de Vibrio utilizadas en esta investigación.
Al Laboratorio de Genética y Biología Molecular de Plantas, en especial a la Dra. María Auxiliadora Islas Osuna, la Dra. Carmen Contreras Vergara y al M.C. Angel Javier Ojeda Contreras por permitirme el uso del equipo de laboratorio y por su gran disposición.
A mi compañera Cindy Melina Colosio López por el apoyo técnico brindado en el laboratorio y por la paciencia que me tuvo durante mi capacitación en técnicas microbiológicas.
Al Laboratorio de Inmunología y Microbiología en especial a la Dra.
Verónica Mata Haro por permitirme trabajar en su laboratorio y utilizar el equipo bajo su responsabilidad. Además, quiero agradecerle el compartir conmigo sus conocimientos, gracias por sus comentarios y sugerencias.
Al Laboratorio de Microbiología Molecular, en especial a la Q.B.
Rosalva Pérez Morales y Germán Jacquez Muñoz, por su disposición y apoyo técnico recibido durante mi capacitación en el uso del equipo del laboratorio.
Al Laboratorio de Bioquímica de Proteínas de Estrés en especial a la M.C. Ciria Guadalupe Figueroa Soto por permitirme hacer uso del equipo de laboratorio.
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DDEDICATORIASEDICATORIASEDICATORIAS EDICATORIAS
A DiosDiosDios por ser esa luz que me ha guiado y protegido a lo largo de mi vida. Dios
A mis padresmis padresmis padresmis padres José y Lupita por darme siempre su apoyo incondicional, por ser un gran ejemplo a seguir y ayudarme a ser una mejor persona, por enseñarme a luchar para seguir adelante, gracias!
A mis hermanosmis hermanosmis hermanos José Alberto, Emmanuel y Marco por estar siempre a mi lado, por mis hermanos compartir tantos bonitos momentos conmigo que a lo largo de nuestras vidas hemos pasado.
A mimimimi sososobrinitosobrinitobrinitobrinito que viene en camino que con tantas ansias espero, que ya hacía falta en la familia para alegrarnos más la vida.
A mimimimi gran amigagran amigagran amiga Karla por darme siempre su apoyo, por abrirme las puertas de su gran amiga hogar y brindarme incondicionalmente su amistad.
A mi mi mi noviomi novionovionovio Juan Carlos por estar a mi lado y darme todo su amor y cariño en las buenas y en las malas, por todo el apoyo y ánimo que me ha brindado, amor gracias!
A mis amigomis amigomis amigomis amigossss en especial a Anna, Marina, Max, Manolo “el plebe” por hacer mas amena y divertida mi estancia en el CIAD y por brindarme su amistad incondicional a lo largo de estos dos años, amigos gracias!
vii CONTENIDO
Página LISTA DE FIGURAS9999999999999999999999999...x LISTA DE TABLAS 99999999999999999999999999xi RESUMEN.99999999999999999999999999999.xii ABSTRACT99999999999999999999999999999xiii INTRODUCCIÓN999999999999999999999999999.1
ANTECEDENTES99999..999999999999999999999.3 La Problemática de la Camaronicultura en México9999999999993 Generalidades de las Bacterias del Género Vibrio99999.99999994 Características Fisiológicas y/o Morfológicas de la Familia
Vibrionacea99999999999999999999999999..9..6 Aislamiento de Bacterias del Género Vibrio9999999999..999..7 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la Identificación de bacterias de Vibrio9999999999999..9999999...8 Factores Abióticos que Intervienen en el Desarrollo del Camarón Blanco Litopenaues vannamei999999999999999999999...10 Temperatura9.999999999999999999999999..910 Salinidad999999999999999999999999999..911 Oxígeno Disuelto (OD)999999999999999999999.9.11 Potencial de Hidrógeno (pH)9999999999999999..999..12 Concentración de Nitrógeno Amoniacal Total (TAN)9999.99999..13 Concentración de Nitritos (NO2)999999999999999999..14 Concentración de Iones Minerales en el Agua del Estanque de Cultivo99.16 Calcio99999999999999999999999999999...18 Magnesio99999999999999999999999.9999919 Potasio9999999999999999999999999999.919 Uso de Antibióticos en la Acuicultura99999999999999999.21
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Características de Oxitetraciclina9999999..9999999999..22 Desarrollo de Resistencia Bacteriana por el Uso de Oxitetraciclina9..9923 Uso de Sistemas Cerrados para el Cultivo de Camarón999999999.24 HIPÓTESIS9999999999999999999999999999927 OBJETIVOS9999999999999999999999999999...28 Objetivo General...28 Objetivos Específicos9999...9999999999999999999.28 MATERIALES Y MÉTODOS999999999999999999999...29 Diseño Experimental999999...99999999999999999..29 Medición de Parámetros Fisicoquímicos9999...9999999999930 Determinación de Ganancia de Peso en Camarón99..99999999...30 Determinación de la Sobrevivencia en Camarón99...999999999..30 Concentración de los Iones Ca, Mg y K, Nitrógeno Amoniacal
Total (TAN) y Nitritos (NO2) en el Agua del Estanque de cultivo9..999931 Determinación de Calcio99999999999999999..9999.31 Determinación de Potasio999999999999999..99999...32 Determinación de Magnesio...99999999999999..9999...32 Nitrógeno Amoniacal Total999.99999999999999999..33 Nitritos (NO2)9999999..9999999999999999999.33 Diagnóstico para la Detección de Lesiones Externas e Internas en
Camarón.999999999999999999..9999999999..34 Análisis Bacteriológico en los Órganos del Camarón9999999999..36 Extracción de Hemolinfa999999.999999999999999..36 Extracción de Hepatopáncreas y Branquias de Camarón9999..999.37 Aislamiento de Bacterias del Género Vibrio9.99999.999999938 Detección de Especies de Vibrio Aisladas de Camarón
Litopenaeus vannamei9999999999999999..999999...39 Extracción de ADN a partir de Aislamientos Bacterianos de Tejidos
de Camarón99.999999999999999999999999...39 Determinación de la Concentración de ADN9.99999999999940 Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR)999999.999999.40 Electroforesis en Gel de Agarosa99999999..999999999..41
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Determinación de las Concentraciones Mínimas Inhibitorias (CMI) en
Bacterias de Vibrio999999999..999999999999999..43 Análisis Estadístico9999999999999..99999999999.45 RESULTADOS Y DISCUSIÓN99999999999999999999...46 Parámetros Fisicoquímicos9999999999..9999999999...46 Determinación de Ganancia de Peso y Sobrevivencia en Camarón99...9.47 Concentración de Iones (Ca, Mg y K) en el Agua del Estanque99999...48 Concentración de Nitrógeno Amoniacal Total (TAN) y Nitritos (NO2) en el Agua del Estanque9.99999999999999999999999...51 Evaluación de Lesiones Internas y Externas en Camarón Litopenaeus
vannamei99999999999999999999999...54 Análisis Bacteriológico (Branquias, Hemolinfa y Hepatopáncreas) en
Camarón Litopenaeus vannamei 99..999999999999999955 Cuenta Total Bacteriana en Tejidos de Camarón999999999..9..56 Recuento de Bacterias del Género Vibrio Aisladas de los
Distintos Tejidos de Camarón 999.9.99999999999999...57 Detección de Especies de Vibrio Aisladas de Camarón de cultivo
Litopenaeusvannamei...9999999999999999999999...59 Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) de la Oxitetraciclina en Cepas de Vibrio Aisladas de Camarón999..99999999999999999..64 RESUMEN DE HALLAZGOS 99999999999999999999966 CONCLUSIONES99999999999999999999999999.67 BIBLIOGRAFÍA999999999999999999999999999.68
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LISTA DE FIGURAS
Figura Página
1. Ciclo del Nitrógeno en un Estanque de Cultivo999999999999...16 2. Determinación de Iones en el Agua de Mar99999999999999.33 3. Procedimiento para la Extracción de Hemolinfa de Camarón Litopenaeus vannamei99999999999999999999999999999937 4. Extracción de los Órganos de Camarón Litopenaeus vannamei99999..38 5. Concentración de los Iones Ca, Mg y K en el Agua del Estanque
Durante La Evaluación del Sistema Cerrado de Cultivo de Camarón.999949 6. Comportamiento de Nitrógeno Amoniacal Total (TAN) y Nitritos (NO2)
Durante la Evaluación del Sistema para el Cultivo de Camarón99...52 7. Amplificación mediante PCR del gen 16s RNA999999999999...60 8. Amplificación mediante PCR del gen de hemolisina en cepas de Vibrio...61 9. Amplificación mediante PCR del gen toxR en cepas Vibrio9..9999.9...62
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LISTA DE TABLAS
Tabla Página
1. Criterios para Establecer el Grado de Severidad de las Lesiones en los
Distintos Órganos de Camarón99999999999999999999..35 2. Condiciones de PCR Para Cada uno de los Oligonucleótidos
Iniciadores Utilizados en la Identificación de Especies de Vibrio999999..42 3. Distribución de las Muestras en la Placa Para la Determinación de la
Concentración Mínima Inhibitoria de la Oxitetraciclina en Bacterias de Vibrio...44
4. Parámetros Fisicoquímicos Evaluados en el Sistema Cerrado para el Cultivo de Camarón L. vannamei..9999999999999999..9946 5. Evaluación del Daño en los Distintos Órganos de Camarón Litopenaeus vannamei Cultivado en un Sistema Cerrado99999999999999955
6. Cuenta Total Bacteriana en Tejidos de Camarón Litopenaeus vannamei9..56 7. Evaluación de Bacterias de Vibrio Sacarosa (+) Aisladas de Diferentes
Tejidos de Camarón Litopenaeus vannamei999999999...9999.957 8. Concentración Mínima Inhibitoria de la Oxitetraciclina en Bacterias
de Vibrio Aisladas de los Diferentes Tejidos de Camarón999999999.65
xii RESUMEN
La camaronicultura es una actividad industrial importante para el estado de Sonora. La producción de camarón en sistemas tradicionales disminuyó drásticamente en los tres últimos años, debido a la alta tasa de mortalidad de los organismos en cultivo, provocada por infecciones virales y bacterianas, lo que ocasionó pérdidas económicas cuantiosas. En esta investigación se estudió el desarrollo de camarón blanco L. vannamei en un Sistema de Cultivo Cerrado, evaluando aspectos fisicoquímicos, fisiológicos y microbiológicos. Se realizó un bioensayo durante 58 días en una granja comercial ubicada en Bahía de Kino, Sonora, empleando un estanque tipo invernadero de 0.04 Ha, sembrado con 126 organismos/m2. Se determinaron parámetros fisicoquímicos, como temperatura, oxígeno disuelto (OD), pH, salinidad y nitritos, así como la severidad de lesiones en los órganos del camarón, cuenta total bacteriana y de Vibrio en hemolinfa, hepatopáncreas y branquias y la sensibilidad a oxitetraciclina por dilución en microplacas. Además, se realizó la identificación de la especie por técnicas moleculares (PCR) en las cepas bacterianas de Vibrio aisladas de los tejidos de camarón. Los valores obtenidos en los parámetros fisicoquímicos del agua del estanque fueron: temperatura 30.44±1.0°C, OD 4.71±0.64 mg/L, pH 7.34±0.15 y salinidad 39.90±0.88‰. Los niveles de nitritos en el agua estuvieron por arriba del valor recomendado (0.01 mg/L), encontrándose en promedio una concentración de 4.84±4.40 mg/L, observando en los camarones una disminución en las mudas, aparición de cromatóforos en el intestino y necrosis en la cutícula. La concentración de iones en el agua fue de 168.80±14.10, 920.00±339.40 y 88.31±22.70 mg/L para Ca, Mg y K, respectivamente. Los camarones tuvieron un incremento en peso de 1.95±0.64 g/semana y una sobrevivencia del 74%. No se detectaron lesiones severas en los órganos de los camarones al término del bioensayo. Las cuentas bacterianas se mantuvieron por debajo de los niveles recomendados (5x103 UFC/g). La Concentración Mínima Inhibitoria para la oxitetraciclina fue de 0.39- 100 µg/mL en bacterias aisladas de hepatopáncreas, 0.78-325 µg/mL en branquias y 0.78-75 µg/mL en hemolinfa. Se detectó mediante la técnica de PCR la presencia de bacterias del género Vibrio spp. y Vibrio harveyi, aisladas de los distintos tejidos de camarón. Los resultados obtenidos mostraron que el Sistema de Cultivo Cerrado permitió un mayor control de los parámetros evaluados, lo que favoreció el desarrollo de los organismos, por lo que se puede proponer este sistema como una alternativa viable para el cultivo de camarón Litopenaeus vannamei en la región.
Palabras clave: camarón, Litopenaeus vannamei, sobrevivencia, Sistema de Cultivo Cerrado, oxitetraciclina.
xiii ABSTRACT
Shrimp farming is an important industrial activity in the state of Sonora.
Shrimp production in culture under traditional systems decreased in the last three years, due to the high mortality rate of the organisms, caused by viral and bacterial infections, causing substantial economic losses. In this research we studied an alternative of Shrimp production under a closed culture measuring a series of parameter physicochemical, physiological and microbiological.
Bioassay was performed for 59 days in a commercial farm in Bahia de Kino, Sonora, using a type greenhouse pond of 0.04 ha, to a density of 126 organisms/m3. Measures included in this study were temperature, dissolved oxygen (DO), pH, salinity and nitrite, and the severity of organ damage shrimp, total bacterial count and Vibrio in hemolymph, hepatopancreas and gills and sensitivity to oxytetracycline by dilution on microplates. In addition, we also performed the species identification by molecular techniques (PCR) from bacterial strains Vibrio isolated from tissues of shrimp. Physicochemical parameters related to the pond water were temperature 30.44 ± 1.0 ° C, DO 4.71 ± 0.64 mg / L, pH 7.34 ± 0.15 and 39.90 ± 0.88 ‰ salinity. Nitrite levels in the water were 4.84±4.40 mg/L which was above the recommended value of 0.01 mg/L, this results were a decline in shrimp molts, chromatophores in the intestine and necrosis in the cuticle. The concentration of ions in water was 168.80±14.10, 920.00±339.40 and 88.31±22.70 mg/L for Ca, Mg and K, respectively. Furthermore, shrimp had an increase in weight of 1.95±0.64 g/week and a survival rate of 74%. No serious damage were detected in the organs of the shrimp at the end of the study. The bacterial counts were below of recommendations (5x103 CFU/g). The minimum inhibitory concentration for oxytetracycline was 0.39 to 100 µg/mL in bacteria isolated from hepatopancreas, from 0.78 to 325 µg/mL in gills and from 0.78 to 75 µg/mL in hemolymph. The species of bacteria detected from different tissues of shrimp were Vibrio spp. and Vibrio hemolisin gen and toxR. Given that closed culture system allowed greater control of the parameters evaluated and a better development of organisms, this system can be proposed as a viable alternative for Litopenaeus vannamei shrimp farming in the region.
Keywords: shrimp Litopenaeus vannamei, survival, closed culture system, oxytetracycline.
1 INTRODUCCIÓN
La acuacultura provee el 45 % de los productos acuícolas a nivel mundial, siendo el camarón, el producto que mayormente se comercializa, generando una producción mundial de aproximadamente seis millones de Ton (FAO, 2009). En México, se ha registrado un crecimiento constante en la industria camaronícola, representando una de las principales fuentes alimenticias tanto para consumo nacional como de exportación. Actualmente, es una de las actividades productivas más importantes en el estado de Sonora, siendo el camarón de la especie Litopenaeus vannamei el mayormente cultivado, debido al amplio conocimiento que se tiene en relación a su cultivo y manejo. Sin embargo, una de las principales limitantes en el crecimiento y sustentabilidad de esta actividad industrial, es la presencia de enfermedades, tanto virales como bacterianas, en los sistemas de cultivo (COSAES, 2010).
En relación a las enfermedades bacterianas que afectan los cultivos de camarón, las infecciones ocasionadas por bacterias del género Vibrio son las más comunes, debido a que habitan de manera natural el ambiente marino y son consideradas patógenos oportunistas que pueden infectar al camarón en cualquiera de sus etapas de desarrollo (González, 2003). Ante esto, es necesario aplicar medidas de bioseguridad y un monitoreo constante para la detección de bacterias patógenas (Galaviz et al., 2007).
Debido a la difícil situación que representa mantener un control sobre las enfermedades que afectan los cultivos de camarón, es que se plantea el uso de sistemas de producción cerrados, como una alternativa viable para el cultivo de camarón Litopenaeus vannamei. Estos sistemas proporcionan un ambiente mejor controlado para promover el crecimiento de los organismos acuáticos, mediante el monitoreo de parámetros que incluyen concentraciones de oxígeno disuelto (OD), nitrógeno amoniacal total (TAN), nitritos, dióxido de carbono
2 (CO2), temperatura, potencial de Hidrógeno (pH) y los niveles de alcalinidad en el sistema. Además, tienen un bajo impacto ambiental ya que se reutiliza el agua, previo tratamiento físico, químico y biológico. También, se emplea menos del 10 % del agua requerida en un sistema de producción convencional. Por esta razón, desde hace más de tres décadas, se han realizado investigaciones relacionadas con sistemas de cultivo cerrados o con recirculación de agua en la industria acuícola y aproximadamente una década en la producción intensiva de organismos (Timmons et al., 2002).
3 ANTECEDENTES
La Problemática de la Camaronicultura en México
La camaronicultura es un área que ha tenido gran desarrollo desde finales del siglo pasado. Sin embargo, conforme se ha incrementado la producción de camarón por unidad de superficie en los sistemas intensivos, la susceptibilidad de los organismos a contraer enfermedades también se ha aumentado, debido principalmente al estrés que sufren por las altas densidades de siembra, o bien por la pobre calidad del agua y los alimentos deficientes, lo cual ha generado un colapso de esta industria en distintos países como, China, Tailandia, Indonesia, Taiwán, Ecuador y México (Flegel, 2012).
Normalmente, cuando se habla de agentes patógenos causantes de cuantiosas pérdidas en la industria camaronícola, se hace referencia a las infecciones virales, como el Virus de la Mancha Blanca (WSSV), el Virus de la Cabeza Amarrilla (YHV), Virus del Síndrome de Taura (TSV) entre otros, debido a la gran mortalidad que pueden ocasionar en un período corto (Galaviz-Silva et al., 2004), Sin embargo, existen otros patógenos que también causan daños considerables en la producción de camarón, como las infecciones ocasionadas por las bacterias del género Vibrio.
Distintas especies de Vibrio han sido reportadas a nivel mundial como las causantes de grandes pérdidas en la producción de camarón cultivado, ya que han generado mortalidades que alcanzaron hasta el 100% de los organismos, particularmente en la etapa postlarvaria y juvenil (Aguirre-Guzmán, 2004).
También, otras bacterias causan enfermedades en camarones marinos (Álvarez et al., 2000; Rendón y Balcázar, 2003), como la bacteria intracelular tipo rickettsia causante de la Hepatopancreatitis Necrotizante (NHP), que se
4 caracteriza por la inflamación y necrosis del hepatopáncreas de los camarones.
Estas bacterias atacan las células del epitelio del hepatopáncreas, provocando en este órgano una coloración pálida, las células hepatopancreáticas aparecen hipertrofiadas y con gran cantidad de bacterias en el citoplasma (Gómez-Gil et al., 2001; Morales, 2004).
La infección denominada erosión bacteriana del caparazón se presenta en todas las especies de peneidos, manifestándose por la aparición de manchas cafés o negras ocasionadas por bacterias quitinolíticas. Esta infección se ha asociado a Vibrio sp., Aeromonas sp., Spirillum sp. y Flavobacterium sp., representando una amenaza para los camarones en cultivo, cuando estos se encuentran en condiciones de estrés severo (Morales, 2004;
Santiago, 2009).
Esta problemática ha hecho necesario mantener monitoreos constantes de la población bacteriana, para evitar devaluar la calidad del producto. Para ello, la identificación bacteriana por medio de pruebas de diagnóstico, determinan las características coloniales de las bacterias, generando información que ayude a mantener un control sobre la proliferación de los microrganismos y así lograr aplicar tratamientos preventivos efectivos (Valenzuela-Salcedo et al., 2008).
Generalidades de las Bacterias del Género Vibrio
Las bacterias que conforman el género Vibrio se caracterizan por habitar naturalmente el medio marino (Soto-Rodríguez et al., 2010). Estas bacterias juegan un importante papel dentro del ciclo de nutrientes, mediante la remineralización de nutrientes orgánicos como carbono (C), nitrógeno (N) y fósforo (P) (Pruzzo et al., 2005; Leyton y Riquelme, 2008), sin representar un riesgo para la salud de los organismos en cultivo, excepto cuando éste posee alguna deficiencia nutricional, inmunológica o genética, y/o que esté siendo cultivado bajo un estrés ambiental ocasionado por la pobre calidad del agua,
5 una elevada densidad de siembra, una alta temperatura del agua, baja concentración del oxígeno disuelto y una baja tasa de recambio de agua (Aguirre-Guzmán, 2004; Venkateswara-Rao, 2009).
Las bacterias del género Vibrio son patógenos oportunistas que pueden tomar ventaja de los cambios ecológicos generados durante el cultivo, provocando infecciones. También, forman parte importante de la población bacteriana del camarón y del medio ambiente que lo rodea, convirtiéndose por lo tanto, en una posible y constante fuente de infecciones para estos organismos (Aguirre-Guzmán, 2004). La severidad de la infección en el camarón dependerá de la especie y la cepa de Vibrio involucrada, el estado de desarrollo y edad del camarón, así como de las condiciones ambientales (Jayasree et al., 2006).
Las enfermedades generadas por estas bacterias han sido descritas como: Vibriosis, Enfermedad Bacterial, Septicemia Bacteriana de los Peneidos, Vibriosis de los Peneidos, Vibriosis Luminiscente y Enfermedad de las Patas Rojas. Los camarones afectados por alguna especie patógena de Vibrio spp., muestran distintos signos de la enfermedad como letargia, intestino semi-vacío, anorexia, flexión dorsal abdominal, fuerte colonización bacteriana en la cutícula, opacidad en el músculo abdominal, cromatóforos visibles en la base de las apéndices, nódulos melanizados en el hepatopáncreas, retardo en la coagulación de la hemolinfa y reducción de hemocitos, esto principalmente en la etapa larvaria (López, 1998).
Además, se puede observar un gran número de bacterias en la hemolinfa durante una septicemia bacteriana, mediante la realización de análisis microscópicos en fresco. Necrosis, granulomas, inflamación de órganos (órgano linfoide, branquias, corazón, hepatopáncreas, etc.) son fáciles de evaluar por medio de técnicas histológicas.
Las especies del género Vibrio que han sido involucradas en las enfermedades que se presentan en el camarón son: Vibrio harveyi, V.
parahaemolyticus, V. cholerae, V. vulnificus, V. alginolyticus, V. damselae (actualmente Photobacterium damselae), V. penaeicida, V. anguillarum, V.
6 nereis, V. campbelli, V. tubiashi y V. fluvialis, las cuales pueden afectar cualquiera de las etapas de desarrollo del camarón (Aguirre-Guzman, 2004;
Kitiyodom et al., 2010).
Algunas especies de Vibrio expresan genes de toxicidad como el gen toxR el cual fue descubierto primero como un regulador transcripcional positivo que codifica la toxina de Vibrio cholera (Pang et al., 2006). Otro gen que puede estar presente en las especies de Vibrio es el gen de hemolisina, en general las bacterias que expresan este gen, son consideradas patógenas ya que causan hemorragias, septicemia y diarrea en los hospederos. Algunos tipos de hemolisinas se han caracterizado y los genes que las codifican han sido clonados en Vibrio parahaemolyticus, V. cholera, V. hollisae, V. mimicus, V.
vulnificus y V. anguillarum (Zhang et al., 2001).
Los problemas que implican los brotes por bacterias del género Vibrio en la industria del cultivo de camarón, ha encaminado a la búsqueda de nuevas estrategias para prevenir brotes de enfermedad. Éstas incluyen el uso de la llamada “agua-verde”, aplicación de probióticos, uso de reservorios y cloración de estanques durante el periodo de cultivo (Caipang y Aguana, 2011).
Características Fisiológicas y/o Morfológicas de la Familia Vibrionacea
El género Vibrio ésta conformado aproximadamente por 135 especies (http://www.vibriobiology.net), caracterizadas por ser bacilos Gram (-), con movilidad por un flagelo polar, siendo la mayoría de ellas oxidasa (+) y no producen esporas (Dikow, 2011). Son bacterias facultativas anaerobias, teniendo ambos metabolismos respiratorio y fermentativo, reducen nitrato a nitrito, fermentan D-glucosa la cual es utilizada como su única o principal fuente de carbono y usan el amonio como su única fuente de nitrógeno. La mayoría de las especies de este género bacteriano requieren sodio (Na) para crecer y requieren de 0.5-3% de NaCl para tener un óptimo crecimiento. Todas las
7 especies de Vibrio excepto V. cholerae y V. mimicus requieren de Na para su desarrollo (Pruzzo et al., 2005; Caipang y Aguana, 2011).
La mayoría de las bacterias de Vibrio pueden crecer en condiciones levemente alcalinas, de preferencia en un intervalo de pH entre 7 y 8. Algunas especies, incluyendo V. cholerae y V. metschnikovii pueden crecer a pH de 10.
En relación a sus requerimientos de temperatura, se puede decir que la mayoría de las especies de Vibrio crecen adecuadamente a una temperatura de 18-22°C. Pero también existen algunas especies de este género que pueden crecer a temperaturas de 0-4°C, mientras que otras pueden desarrollarse perfectamente a temperaturas por arriba de los 45°C (Soto et al., 2009).
Aislamiento de Bacterias del Género Vibrio
Existen diversos medios de cultivo para el aislamiento de las bacterias pertenecientes a este género, entre los cuales destacan el Agar Marino, el cual es un medio no selectivo, donde casi todas las cepas de Vibrio pueden crecer y es el más utilizado para la determinación de cuentas totales de Vibrio y protobacterias. También es útil para el aislamiento y crecimiento de organismos cuyo hábitat natural son ambientes marinos u otros ambientes con un alto contenido de sodio (Na).
El agar Tiosulfato-Citrato-Bilis-Sacarosa (TCBS) es el medio de cultivo más ampliamente utilizado para el aislamiento de cepas de Vibrio provenientes del ambiente. Aunque no se debe descartar que en este medio de cultivo también pueden crecer otras bacterias como Pseudomonas spp. y Aeromonas spp. Se ha observado que cuando las bacterias de Vibrio utilizan la sacarosa como fuente de carbono producen ácido, apareciendo las colonias en la placa de cultivo de color amarillo (Vibrio alginolyticus, V. cholerae, V. angillarum, V.
fluvialis). Las bacterias de Vibrio que crecen sin utilizar sacarosa aparecen de color verde (Vibrio parahaemolyticus, V. damsella, V. fisheri, V. mimicus, V.
bollisea, V. harveyi) (Ibarra et al., 2004).
8 Otro medio de cultivo que puede ser utilizado para el aislamiento y crecimiento de este género es el agua peptonada alcalina. Ésta es utilizada como medio de enriquecimiento para Vibrio cholerae y otras especies de Vibrio, que a menudo crecen mejor que los microorganismos no deseados, empleando un pH alto. La cantidad de NaCl utilizada para la preparación de agua peptonada alcalina no está estandarizada pero usualmente está en el intervalo de 0.5-1% y puede incrementar hasta 2% para mejorar el crecimiento de las cepas de Vibrio aisladas del medio marino. Si el contenido de NaCl en el medio de cultivo se omite, se hace más selectivo para el crecimiento de las especies como V. cholerae y V. mimicus (Soto et al., 2009; Nishibuchi y DePaola, 2005).
Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para la Identificación de Bacterias de Vibrio
Los avances en la instrumentación y los descubrimientos en bioquímica y biología molecular han permitido generar información genética de los microrganismos, la cual, es utilizada como una herramienta para la identificación y cuantificación de las bacterias que son de interés para el hombre. Entre estos métodos destacan la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR), la cual ha sido aplicada en el diagnóstico de ciertas infecciones en camarones peneidos (Olsen, 2000).
El descubrimiento de la PCR ha permitido la amplificación selectiva de secuencias específicas de ADN que se encuentran en cantidades muy pequeñas. Como su nombre lo indica, esta técnica analítica se basa en la actividad de la enzima ADN polimerasa que es capaz de sintetizar una cadena de ADN complementaria a otra ya existente. El método de PCR utiliza dos secuencias cortas de oligonucleótidos llamadas iniciadores o cebadores que son complementarios a los extremos de la región de ADN que se pretende amplificar. La reacción incluye ADN que puede ser en varias formas, por ejemplo, ADN purificado a partir de un lisado de tejido, iniciadores, la enzima polimerasa y nucleótidos para formar nuevas copias. En cada ronda de la
9 reacción en un termociclador, la muestra de ADN es desnaturalizada, los iniciadores se alinean a sus regiones complementarias y la enzima polimerasa cataliza la adición de los nucleótidos al final de cada primer, creando así, nuevas copias de la región blanco (McBeath et al., 2000).
Las principales ventajas del uso de PCR en la detección e identificación de microrganismos radica en tres aspectos fundamentales: su sensibilidad, especificidad y capacidad de procesamiento de un gran número de muestras, además la obtención de los resultados es rápida (2 a 3 días) y no es necesario el uso de material radioactivo (Rojas-Herrera y González-Flores, 2006).
Adicionalmente este método identifica microrganismos que no pueden ser estudiados por técnicas convencionales o que no pueden cultivarse en substratos artificiales.
Entre los factores que limitan la aplicación de la técnica de PCR para la identificación de microrganismos patógenos en muestras de alimentos, destaca la presencia de sustancias que pueden ejercer un efecto inhibitorio sobre la reacción y pueden actuar a diferentes niveles durante el proceso de extracción y amplificación de los ácidos nucleicos y eventualmente, conducir a la obtención de falsos negativos (Rojas-Herrera y González-Flores, 2006).
Entre los compuestos que ejercen un efecto negativo, se encuentran la hemoglobina, la lactoferrina, los polisacáridos, las grasas, proteínas y los iones metálicos, presentes en las matrices alimenticias. La interferencia de estos compuestos puede ser eliminada empleando un proceso de pre-enriquecimiento o mediante la utilización de enzimas apropiadas (polimerasas) (Gentry et al., 2002).
El uso de PCR para la detección de bacterias patógenas es sumamente importante ya que estos organismos habitan los ambientes marinos. Una detección precisa y temprana de estos patógenos es un factor crucial para el éxito de las operaciones de cultivo y la acuacultura (Cunningham, 2002; Tarr et al., 2007).
10 Factores Abióticos que Intervienen en el Desarrollo del Camarón Blanco
Litopenaeus vannamei
El camarón de cultivo L. vannamei requiere ciertas condiciones ambientales específicas como, temperatura, pH, oxígeno disuelto, concentración de amonio y salinidad para un desarrollo óptimo. Por ello, es importante medir y controlar dichos parámetros durante su ciclo de cultivo. Los cambios drásticos en estos parámetros fisicoquímicos pueden causar estrés en el camarón y favorecer la proliferación de patógenos, los cuales podrían provocar infecciones, un lento crecimiento de los organismos o la muerte, reflejándose esto en pérdidas económicas cuantiosas para el sector productivo camaronícola (Venkateswara-Rao, 2009).
Temperatura
La temperatura es uno de los parámetros más importantes para el desarrollo y sobrevivencia del camarón. Tiene un efecto significativo en el metabolismo del organismo, principalmente en la actividad enzimática, consumo de alimento y tasa de crecimiento. La temperatura óptima para el desarrollo del camarón L. vannamei se modifica con la edad. De tal modo que los camarones con un peso menor a 5 g requieren una temperatura de 30°C, mientras que los de mayor peso requieren temperaturas cercanas a los 27°C (Cuzón et al., 2004;
Jiang et al., 2000).
Los camarones pueden soportar temperaturas menores a 18°C, pero esto les ocasiona que dejen de alimentarse y entrar en un estado de letargo.
Temperaturas superiores a 30°C, podrían acelerar su metabolismo ocasionando pérdida de peso, necesitando consumir más alimento balanceado. Además, los camarones pueden mostrar un comportamiento poco común. La temperatura máxima que puede asegurar la sobrevivencia de estos crustáceos es de 28°C, siendo el intervalo ideal para su crecimiento de 27 a 31°C (Limsuwan, 2005).
11 Salinidad
La salinidad del agua es otro de los factores ambientales que debe considerarse, ya que este parámetro determina la distribución de los organismos en el sistema de cultivo. Cambios drásticos en la salinidad del agua pueden alterar el crecimiento y la respuesta fisiológica de los organismos en cultivo (Li et al., 2008; Sen et al., 2009).
Los camarones son organismos eurihalinos, esto es, que pueden soportar variaciones amplias de salinidad, de tal modo que salinidades de 30 ‰ son apropiadas para la reproducción, eclosión y el desarrollo larvario, pero son requeridas salinidades de 15 ‰ en la etapa postlarvaria y juvenil del camarón (Auró y Ocampo, 2006).
La salinidad óptima para el crecimiento de las distintas especies de crustáceos, dependerá de las diferencias en su capacidad osmótica (CO).
Especies con una alta hiper-CO crecen mejor en salinidades bajas, mientras que especies con baja hiper-CO se desarrollan más en salinidades elevadas (Brito et al., 2000).
El camarón de la especie L. vannamei tiene la capacidad de tolerar un amplio rango de salinidad desde 0.5 hasta 50 ‰, convirtiéndola en una especie particularmente adaptable, con un desarrollo óptimo a una salinidad de 20‰
(Roy et al., 2007; Li et al., 2007; Saoud et al., 2003)
Oxígeno Disuelto (OD)
El oxígeno disuelto en el agua es uno de los principales factores causantes de estrés en la acuicultura, ya que tiene un efecto destacado en el desarrollo de los organismos, afectando directamente en el consumo del alimento y el metabolismo. Cambios bruscos en este parámetro afectan la solubilidad y disponibilidad de algunos nutrientes (Venkateswara-Rao, 2009).
12 Gran parte del OD en el agua, proviene de la atmósfera y de la fotosíntesis. La concentración de OD puede disminuirse por cambios de temperatura, la muerte de fitoplancton dominante, la reproducción excesiva de zooplancton y la descomposición o acumulación de materia orgánica en los estanques, incluyendo el alimento no consumido y las heces (Jiang et al., 2005).
Los camarones del género L. vannamei requieren para su desarrollo concentraciones de OD mayores a 3 mg/L, siendo la concentración óptima cercana a los 5 mg/L. Un exceso de OD puede ser perjudicial y causar la enfermedad conocida como “burbujas de gas”. (Venkateswara-Rao, 2009).
Potencial de Hidrógeno (pH)
En el agua de los estanques, los niveles de pH varían de 6.6 a 10.2 debido a la eliminación de dióxido de carbono (CO2), proveniente de la fotosíntesis durante el día y de la liberación de CO2 por las plantas y animales durante la noche. Una gran cantidad de organismos acuáticos se adaptan a un valor específico de pH y pueden morir si éste cambia a un nivel mínimo de 4.
Los camarones en etapa juvenil son más sensibles a los cambios de pH y no pueden sobrevivir dentro del agua con niveles extremadamente altos o bajos de pH (9.6 o 4.5) (Li y Chen, 2008).
El pH es un parámetro químico de gran importancia ya que afecta el metabolismo y otros procesos fisiológicos de los organismos cultivados. El intervalo de pH 6.8-8.7 debe ser mantenido para un crecimiento y una producción aceptable. Sin embargo, en cultivos semi-intensivos es mejor mantener un intervalo entre 7.4-8.5. Los cambios de pH en los estanques está principalmente influenciado por la concentración de CO2 y los iones en equilibrio con este. El pH también puede ser alterado por: a) los ácidos orgánicos que son producidos por bacterias anaeróbicas, b) los minerales ácidos como el ácido sulfúrico, c) la aplicación de hidróxido de calcio (Venkateswara-Rao, 2009).
13 En los sistemas de cultivo de camarón L. vannamei es recomendable un valor de pH ligeramente básico (alrededor de 7.5), similar al pH del protoplasma de las células, lo que les permitirá a los organismos un mejor desarrollo en todos los niveles tróficos (Venkateswara-Rao, 2009).
Concentración de Nitrógeno Amoniacal Total (TAN)
La mayor fuente de nitrógeno que ingresa a un sistema de cultivo intensivo de camarón es a través del alimento, éste al ser ingerido por los camarones pasa por procesos metabólicos, que le permiten la conversión en biomasa y otra parte es excretada hacia el ambiente acuático (Sánchez y Ching, 2003; Kuhn, 2010). El mecanismo de excreción del camarón es en forma de compuestos nitrogenados totales, que están constituidos por el amoniaco ionizado (NH4+
) y el amoniaco no ionizado (NH3) (Chen, 2003; Isla, 2007). En los crustáceos decápodos, el nitrógeno es excretado en mayor cantidad como amonio (60-70%) y en pequeñas cantidades como aminoácidos, urea y ácido úrico (Jiang et al., 2000).
La toxicidad del amonio en los organismos acuáticos se ha atribuido a la forma química NH3,debido a su habilidad para difundirse rápidamente a través de la membrana celular, mientras que la forma química NH4+
se considera no tóxica o significativamente menos tóxica (Crab et al., 2007). La excreción de amonio en los crustáceos es afectada por factores intrínsecos como la talla, el estadio del ciclo de muda y por los factores extrínsecos como la temperatura, la salinidad, pH y OD (Re et al., 2004; Pillay y Kutty, 2005).
Una de las principales reacciones de los organismos acuáticos, al encontrarse en un medio con altos niveles de nitrógeno, puede ser el cese y/o reducción de la alimentación, lo cual reduce la formación del amonio metabólico, manifestándose efectos sub-letales en los organismos como la reducción en la tasa de crecimiento y la sobrevivencia. Los resultados adversos sobre el crecimiento pueden provenir de lo siguiente: (a) una absorción lenta o
14 reducida de oxígeno causada por daño en las branquias, (b) demanda de energía adicional causada por el uso de vías alternativas de desintoxicación, (c) perturbaciones en la regulación osmótica y (d) daños físicos en varios tejidos (Arredondo et al., 2007).
Por ello, es importante monitorear continuamente los niveles de amonio en el agua, de los estanques de cultivo, ya que es recomendable que los valores no sean mayores a 1.2 y 6.5 mg/L, para postlarvas y juveniles respectivamente, evitando de esta forma los efectos tóxicos que este compuesto produce, obteniendo mejores resultados en el cultivo de camarón.
La subestimación de nitrógeno total derivado de la excreción, es un problema potencialmente serio, principalmente en los sistemas cerrados con recirculación de agua (Jiang et al., 2000). Entre los principales y más efectivos métodos aplicados en los sistemas cerrados con recirculación de agua para la remoción de nitrógeno amoniacal total (TAN) se encuentran: (1) el arrastre del aire, proporcionando la denitrificación (2) el intercambio iónico y (3) la biofiltración, siendo este último el mas frecuentemente utilizado en los sistemas cerrados por su bajo costo, operación y mantenimiento (Franco et al., 2004; De la Mora et al., 2003).
Concentración de Nitritos (NO2)
El amonio, es un compuesto derivado de la excreción de compuestos nitrogenados. Mediante un proceso oxidativo llamado nitrificación son convertidos a nitritos por la participación de las bacterias del género Nitrosomonas y Nitrosolobus. Posteriormente, se transforman a nitratos, por la acción de las bacterias del género Nitrobacter y Nitrosococcus (Figura 1). Las bacterias nitrificantes viven de forma natural en los ambientes acuáticos (Sánchez y Ching, 2003; Cervantes et al., 2000; Zhang et al., 2008).
Los nitritos pueden estar presentes en los sistemas de cultivo en niveles tóxicos. Recientemente se ha puesto una mayor atención en estos compuestos,
15 ya que se han considerado contaminantes de los sistemas acuáticos. Durante el proceso de nitrificación, los nitritos pueden aumentar su concentración en los sistemas de cultivo camaronícolas, debido a un desbalance en las poblaciones bacterianas encargadas de los procesos de nitrificación y denitrificación, aun cuando se realicen recambios de agua frecuentes en los estanques. También, la concentración de nitritos puede ser elevada en los cuerpos de agua que reciben los efluentes nitrogenados de los distintos parques acuícolas (Frías- Espericueta et al., 2000).
Generalmente, se detectan en los estanques de producción intensiva de camarón, concentraciones altas de nitritos durante las estaciones de otoño y primavera, que es cuando ocurren fluctuaciones en la temperatura, generando una ruptura en el ciclo del nitrógeno, debido a la disminución del plancton y/o actividad bacteriana, ya que éstos son los principales consumidores del amonio presente en el agua del estanque (Sánchez y Ching, 2003).
El proceso de nitrificación ocurre más rápido a valores de pH de 7 a 8 y temperaturas desde 25 hasta 35°C. Al disminuir la temperatura ambiental ocurre una reducción en la actividad del plancton, ya sea en estanques con fondo de tierra, recubierto con plástico y/o tipo invernaderos. Otros factores que influyen son, la reducción de nutrientes, la presencia de un clima nublado, los tratamientos químicos al agua o los recambios de agua con condiciones físico- químicas diferentes a las del estanque de cultivo, pueden ocasionar que una menor cantidad de amonio sea asimilado por las algas, recayendo esta función en las bacterias nitrificantes existentes en el estanque de cultivo. Entre los principales efectos tóxicos del NO2 destacan aquellos que tienen una relación directa en el transporte de oxígeno, la oxidación de compuestos importantes y aquellos que causan un daño a los tejidos como, branquias y otros órganos internos (Arredondo et al., 2007; Tomasso, 2012).
El efecto de los nitritos en el crecimiento de los camarones dulceacuícolas y marinos ha sido documentado por Armstrong et al. (1976) y por Wickins (1976); quienes observaron que una concentración de nitritos de 1.8 y 6.4 mg/L puede provocar una reducción del 35 y 50%, en el crecimiento
16 de postlarvas de Penaeus indicus. Posteriormente, Chen et al. (1990), determinaron que una concentración de 21.38 mg/L de NO2, redujo al 50% el crecimiento de P. monodon.
Figura 1. Ciclo del nitrógeno en un estanque de cultivo (Sánchez y Ching, 2003).
Concentración de Iones Minerales en el Agua del Estanque de Cultivo
La sobrevivencia y el crecimiento de los camarones en los estanques de cultivo al aire libre es afectado por diversos factores como, el tipo de suelo, la salinidad del agua, la especie del camarón o la salud de las postlarvas.
Además, uno de los factores de mayor importancia en el desarrollo de los organismos es la adecuada concentración de los iones minerales en el agua,
17 debido a que éstos han sido relacionados con la sobrevivencia de los camarones. Son esenciales para la transmisión de los impulsos nerviosos y para las contracciones musculares, juegan un papel vital en el equilibrio ácido- base corporal y consecuentemente regulan el pH de la sangre y otros fluidos corporales, son constituyentes esenciales de las estructuras esqueléticas, tales como huesos y cutículas. El agua marina utilizada para el cultivo de camarón usualmente posee diferente composición iónica (Saoud et al., 2003).
La salinidad del agua depende de la concentración total de los iones disueltos, que básicamente son siete, cuya concentración promedio en el agua de mar es la siguiente: Na 10.5, Mg 1.45, Ca 400.0, K 370.0, Cloruro 19.0, Sulfato 2.7 y Bicarbonato 142.0 mg/L. Entre los principales iones se encuentran el Calcio (Ca), Magnesio (Mg) y Potasio (K) y cada uno de ellos juega un papel fundamental en el desarrollo de los organismos en cultivo.
La salinidad promedio del agua de mar es de 34.5 ‰, disminuyendo durante la temporada de lluvia y aumentando durante el verano, siendo en esta época cuando el agua de mar tiene una mayor salinidad debido a la concentración de los iones a causa del incremento en la temperatura del agua,
lo que provoca una mayor evaporación
(http://www.horcalsa.com/contents/content-files/revista1.pdf). En la etapa postlarvaria es muy importante la capacidad osmoreguladora del camarón. Las postlarvas PL15 y PL20 de camarón L. vannamei toleran mejor la baja salinidad del agua que las postlarvas PL10. Este fenómeno ha sido descrito en otras especies de peneidos, observándose que la tolerancia a la salinidad de las postlarvas depende también de la especie de camarón. Un ejemplo de ello es la especie de L. vannamei ecuatoriano el cual crece mejor a baja salinidad que la misma especie cultivada en México (Saoud et al., 2003).
Por otro lado, la alcalinidad es la capacidad del agua para neutralizar ácidos o aceptar protones. Ésta representa la suma de las bases que pueden ser tituladas en una muestra de agua, dado que la alcalinidad de aguas superficiales está determinada generalmente por el contenido de carbonatos, bicarbonatos e hidróxidos, ésta se toma como un indicador de dichas especies
18 iónicas. El bicarbonato constituye la forma química de mayor contribución a la alcalinidad. Históricamente, la alcalinidad ha sido utilizada como un indicador de la productividad de lagos donde niveles de alcalinidad altos indicarían una productividad alta y viceversa. Ésta debe ser superior a 75 mg/L en el agua de los estanques. La alcalinidad es menor en estanques con suelos ácidos y baja salinidad. Si la alcalinidad es menor a 40‰, se pueden provocar efectos en el camarón, principalmente en el ciclo de muda. Si la alcalinidad es baja y se combina con un pH menor a 7.5 se pueden presentar problemas de mortalidad en el cultivo. Por otro lado, si la alcalinidad es elevada (200-300 ‰) y el pH es mayor de 8.5 los organismos interrumpen su ciclo de muda (Chávez, 2009).
Calcio
El Ca es un elemento muy importante para el crecimiento y bienestar de los camarones y necesario para la formación del nuevo exoesqueleto después de la muda, endureciendo el caparazón del camarón. Este mineral es absorbido a través del tracto gastrointestinal por transporte activo (Davis y Glatin, 1996) y a través de las branquias de los crustáceos.
(http://www.fao.org/docrep/field/003/ab492s/AB492S04.htm).
El Ca estimula la contracción muscular, regula la transmisión del impulso nervioso de una célula a otra, participa en la osmoregulación y además sirve como cofactor en diversas reacciones enzimáticas (Hou et al., 2012); su absorción puede ser facilitada por la acción de la lactosa (Davis y Glatin, 1996).
Una fuente de Ca para los crustáceos, se obtiene de la aplicación de hidróxido de Ca(OH)2 a los estanques de cultivo, ésta es una práctica muy frecuente y dentro de los beneficios que se obtienen con ello, se encuentra la eliminación y control de algunos parásitos de peces y crustáceos. Además, ayuda a mantener el agua con la turbidez adecuada, evitando aguas obscuras que estresen al camarón, se incrementa el pH del suelo y se aumenta la
19 liberación de nutrientes de los fangos del estanque y la descomposición de la materia orgánica (Chávez, 2009).
Magnesio
Otro de los minerales esenciales es el magnesio (Mg), el cual es un componente esencial del exoesqueleto y del mantenimiento de la homeostasis intra- y extracelular de los crustáceos (Davis y Glatin, 1996). Es esencial para la respiración celular y sirve como cofactor o componente de distintos sistemas enzimáticos importantes, en la regeneración celular y en el ciclo reproductivo (Roy et al., 2007).
Este mineral es fácilmente absorbido a través del tracto gastrointestinal, branquias, piel y aletas de peces y crustáceos. La disponibilidad y absorción de Mg se ve reducida en presencia de fitatos y concentraciones elevadas de Ca.
Mantener niveles adecuados de Mg, es importante para que se lleve a cabo la correcta actividad de la enzima Na+-K+-ATPasa, ya que el Mg sirve como cofactor y está involucrado en el metabolismo de lípidos, proteínas y carbohidratos actuando en numerosas reacciones enzimáticas y metabólicas (Roy et al., 2007; http://www.fao.org/docrep/field/003/ab492s/AB492S04.htm).
Entre los signos de una deficiencia de este mineral se encuentran un crecimiento pobre, anorexia, letargia, flacidez muscular, convulsiones y alta mortalidad (Davis y Glatin, 1996).
Potasio
Otro de los iones de gran importancia en la célula es el potasio (K+), que se encuentra en casi todos los fluidos y tejidos blandos del organismo, ya que es el principal catión de los fluidos intracelulares y participa en la regulación de la presión osmótica intracelular. El K+ desempeña una función vital manteniendo
20 el equilibrio ácido-base. Igualmente tiene un papel muy importante en el
metabolismo de los organismos (Chávez, 2009;
http://www.fao.org/docrep/field/003/ab492s/AB492S04.htm).
Niveles inadecuados de K+ en el agua, podrían afectar seriamente la capacidad osmoreguladora de las células (Roy et al. ,2007). Tanto el K+ como el Mg son iones esenciales para el crecimiento, sobrevivencia y función osmoreguladora de los crustáceos. El K+ es importante en la activación de la enzima Na-K-ATPasa, ya que su actividad enzimática está directamente relacionada con la concentración de K+ y la regulación del volumen extracelular (Roy et al., 2007; McGraw y Scarpa, 2003). Además, se ha demostrado que una disminución en los niveles de K+ afectarían al camarón ocasionándole una disminución del crecimiento, anorexia, letargo e incluso la muerte (Zhu et al., 2006).
Una de las sustancias utilizadas para mantener niveles adecuados de K y Mg en el agua, cuando se cultiva camarón a baja salinidad es la aplicación de cloruro de potasio (KCl) y sulfato de potasio y magnesio ((K2SO4-MgSO4) (Roy et al., 2007). McNevin et al. (2004), observaron en Alabama una mayor producción de camarón en aguas con baja salinidad, al incrementar los niveles de K+ (6,2 mg l-1) y Mg2+ (4,6 mg l-1) a 40 y 20 mg l-1, respectivamente, utilizando cloruro de potasio (KCl) y sulfato de potasio y magnesio (K2SO4- MgSO4). Diversos estudios han demostrado un incremento en la sobrevivencia y ganancia de peso en los camarones, cuando se mantienen niveles adecuados en las concentraciones de K+ y Mg2+ en el agua, así como de otros minerales durante la aclimatación de postlarvas en agua con baja salinidad (Roy et al., 2007). Los efectos fisiológicos que se pueden presentar durante el desarrollo de los camarones debido a una deficiencia en la concentración de los iones en el agua pueden ser serios, de ahí la importancia de monitorear constantemente estos minerales, ya sea empleando métodos fotométricos o bien metodologías más complejas como es la Espectrometría de Absorción Atómica. (Roy et al., 2007).
21 Uso de Antibióticos en la Acuicultura
Existen en la actualidad más de 40,000 clases de antibióticos y aproximadamente 80 de ellos son utilizados en la agricultura y en la industria acuícola. Los antibióticos son los compuestos quimioterapéuticos más importantes con capacidad para inhibir el crecimiento de microorganismos o aniquilarlos (Lee et al., 2007; Allison et al., 2001). Se obtienen de manera natural, semi-sintética o sintética y pueden ser aplicados vía parenteral, oral o tópica (Kemper, 2008).
Los antimicrobianos se han utilizado en la producción animal con diversos propósitos, como es el control y tratamiento de enfermedades infecciosas, con fines profilácticos y como promotores de crecimiento, buscando incrementar el peso de los animales o una mayor eficiencia alimentaria (Viola y DeVincent, 2006). En la acuicultura, los antibióticos son utilizados frecuentemente durante los ciclos de cultivo, tanto en los laboratorios de reproducción como en las granjas de cultivo de camarón (Soto-Rodríguez et al., 2006), con la finalidad de disminuir o controlar las enfermedades bacterianas (Uno, 2004).
Cuando se presentan infecciones bacterianas en los camarones peneidos, se aplican terapias empleando alimento adicionado con algún antibiótico, sin embargo, el empleo de dietas medicadas en la acuicultura, ha sido asociado con problemas ambientales y de salud humana. Entre éstos se incluye, la generación de bacterias resistentes, la persistencia de los antibióticos en el sistema acuático y los efectos sobre la composición biogeoquímica del sedimento (Santiago et al., 2009).
También, es importante resaltar que la acumulación de residuos de antibióticos en el músculo de camarón, puede alterar la flora intestinal y provocar problemas de intoxicación o alergias en el consumidor (Santiago et al., 2009). No es recomendable utilizar los antibióticos en la producción animal como medida preventiva, ya que las bacterias desarrollan resistencia a ellos de una manera muy rápida, provocando su ineficacia.
22 La aplicación de antibióticos sólo debe realizarse si existe un diagnóstico adecuado de la situación y siempre bajo protocolos de control previamente establecidos. Además, debe llevarse a cabo una evaluación del impacto por la administración de dicho compuesto, conocer el patrón de uso, la hidrología del área y las condiciones fisicoquímicas del agua. Se deben considerar las buenas prácticas de manejo acuícola como prioridad para evitar la entrada de patógenos a los sistemas de cultivo de camarón y utilizar antibióticos únicamente como último recurso (Santiago et al., 2009).
En la selección de un antibiótico, el costo es un factor importante ya que existen medicamentos muy efectivos contra algún patógeno, pero su precio los hace prácticamente imposibles de utilizar a las dosis adecuadas. En el caso de camarón, la vía de administración de antibióticos más frecuente es la oral, utilizando el alimento como vehículo, el cual es incorporado a un medio marino sumamente agresivo. Debido a esto, es importante que el antibiótico vaya dentro de un “pellet” para mantener su estabilidad y protegerlo de factores como lixiviación y unión a cationes trivalentes y divalentes. El personal responsable de la granja debe verificar que los camarones consuman el alimento para poder aplicar la terapia con el antibiótico ya que de no ser así, los resultados en el control de la enfermedad serán nulos y sólo se contaminará el medio ambiente (Santiago et al., 2009). En México, los antibióticos de uso común en la camaronicultura son enrofloxacina, florfenicol y oxitetraciclina (Soto-Rodríguez et al., 2006). Sin embargo, se conoce muy poco de los efectos terapéuticos de estos antibióticos, en infecciones producidas por bacterias.
Características de la Oxitetraciclina
La oxitetraciclina fue el primer antibiótico aprobado por la Administración de Medicamentos y Alimentos (FDA) para ser utilizado en la acuicultura (Reed et al., 2004). Es un antibiótico bacteriostático perteneciente a la familia de las tetraciclinas, conformado por una estructura tetracíclica. Posee un amplio
23 espectro contra bacterias Gram (+) y Gram (-), rickettsias y micoplasma. Es utilizado en las granjas acuícolas en el tratamiento de vibriosis, hepatopancreatitis necrotizante (NHP) y furunculosis (Mendoza-Patiño y Campos-Sepúlveda, 2008), ejerciendo su efecto antibacterial a nivel del ribosoma. Oxitetraciclina es producida por cepas de Streptomyces rimosus que presenta determinantes de resistencia a este antibiótico (Santiago et al., 2009).
Desarrollo de Resistencia Bacteriana por el Uso de la Oxitetraciclina
La resistencia antimicrobiana se ha convertido en un gran problema de salud y es definida como la capacidad de las bacterias de soportar concentraciones de antibióticos mayores a las que les causa inhibición. Los microorganismos desarrollan esta capacidad de adaptación, debido a sus cortos tiempos de generación y sus constantes mutaciones (COSAES, 2010).
El desarrollo de resistencia bacteriana a antibióticos puede ser intrínseca (perteneciente a la bacteria) o adquirida (Betancourt et al., 2003). La primera se define como aquella que es característica de todos los miembros de una especie o género dado. En muchos casos se refiere a la incapacidad de un antibiótico para causar un efecto en el sitio diana de la célula La resistencia natural o intrínseca no está relacionada con el uso de antibióticos, ya que se manifiesta independientemente de la presencia de éstos (Woodford y Ellington, 2007).
La resistencia adquirida se debe a la modificación del material genético de la bacteria. Puede aparecer como resultado de una mutación al azar de genes localizados en los cromosomas o en sitios extracromosómicos o bien por la transferencia de material genético desde otros microorganismos. Se relaciona también con los procesos dinámicos, como los cambios en el transporte del antibiótico dentro de la célula, cambios moleculares o producción de enzimas que modifican o inactivan al antibiótico Este tipo de resistencia puede estar o no influenciada por el uso de algún compuesto determinado, es decir, el uso de
24 antimicrobianos puede estimular la adquisición de resistencia como parte de un proceso conocido como presión selectiva (Tenover, 2006).
El uso desmedido de antibióticos como profilácticos (Baquero et al., 2009) y la práctica generalizada de administrar dosis bajas de antibióticos como promotores de crecimiento en la producción animal, han favorecido el desarrollo de bacterias resistentes (Tang y Moxon, 2001). La presencia residual de antibióticos en alimentos de origen animal también puede contribuir a aumentar la resistencia bacteriana (Álvarez et al., 2004). En el ambiente acuático, la transferencia de material genético con factores de resistencia a antibióticos es relativamente fácil mediante el proceso de conjugación de plásmidos y puede ocurrir entre cepas del mismo o diferente género (González-Lama et al., 2001).
Las bacterias que desarrollan resistencia a oxitetraciclina, habitualmente presentan resistencia a otros antibióticos y es adquirida por plásmidos. Los mecanismos que dan lugar a la resistencia, pueden ser a través de la pérdida o disminución de la permeabilidad de la pared celular bacteriana para el antibiótico o la adquisición de una vía de salida dependiente de energía, un menor acceso de oxitetraciclina al ribosoma bacteriano o a través de la síntesis de enzimas bacterianas que metabolizan al antibiótico (Mendoza-Patiño y Campos-Sepúlveda, 2008).
Uso de Sistemas Cerrados para el Cultivo de Camarón
La acuicultura tradicional requiere de una gran cantidad de agua y grandes extensiones de terreno. En muchos países de América Latina el agua es un recurso escaso debido al crecimiento poblacional y al cambio climático entre otros factores. Por otro lado, la producción mundial generada por la actividad acuícola ha ido en aumento constante duplicándose en la última década (FAO, 2009).
Según la Organización Mundial para la Alimentación y la Agricultura (FAO), las principales cuestiones que se deben abordar en la acuicultura están
25 relacionadas con la implementación de tecnología apropiada, recursos financieros, el impacto que tendrá al medio ambiente por el desarrollo de esta actividad y la manera de enfrentar las enfermedades que se presentan en este sector (FAO, 2009).
En la acuicultura la implementación de sistemas de cultivo con recirculación de agua engloban un conjunto de procesos y componentes que permiten que el agua sea continuamente tratada y reutilizada. El uso racional del agua es una de las principales ventajas que presentan estos sistemas ya que el volumen de recambio es menor a un 10% diario del volumen total del sistema (Jiménez, 2012).
Este tipo de sistema de producción acuícola, promueve el crecimiento de los organismos ya que les proporciona un ambiente con mayor control de los parámetros fisicoquímicos como la temperatura, el OD, TAN, CO2, pH, la alimentación y principalmente el control de enfermedades, además de permitir realizar cultivos de camarón en los meses de invierno. Los sistemas de cultivo cerrados son considerados bioseguros, sustentables, con poco impacto ecológico, en los cuales se puede producir camarón de alta calidad con una eficiencia costo-beneficio (Timmons et al., 2002).
Los estanques empleados en estos sistemas de cultivo son de tierra, pero también se pueden utilizar membranas de recubrimiento para reducir la erosión y mejorar la calidad del agua. Usualmente, los estanques son pequeños (0.1–1.0 ha) de forma cuadrada o redonda. La profundidad puede ser de hasta 1.5 m y la densidad de siembra varia desde 60 hasta 300 postlarvas/m2.
Entre las principales características que debe poseer un sistema cerrado de producción acuícola se encuentran:
a) La remoción de sólidos conformados por los desechos producidos en el sistema, como las heces y el alimento no consumido.
b) La biofiltración que es utilizada para controlar los compuestos nitrogenados, producto del metabolismo de los organismos.
c) La aireación u oxigenación constante del agua.
d) La degasificación para la eliminación del CO2 acumulado en el sistema.