Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo, A. C.
Caracterización Bioquímica de Quitinasa A y HDL-βGBP de Camarón Blanco Litopenaeus vannamei
Por:
EDGAR FELIPE MORÁN PALACIO.
TESIS APROBADA POR LA COORDINACIÓN DE TECNOLOGIA DE ALIMENTOS DE ORIGEN ANIMAL
COMO REQUISITO PARCIAL PARA OBTENER EL GRADO DE DOCTOR EN CIENCIAS
Hermosillo, Sonora, México Febrero del 2006
RESUMEN
La lipoproteína de alta densidad y unidora de β-glucanos (HDL-βGBP) y la quitinasa, son proteínas involucradas en el desarrollo del camarón. Mientras que la HDL- βGBP actúa en los sistemas de transporte lipídico y de defensa innata, la quitinasa es necesaria en eI ciclo de muda y digestión de quitina. Estas proteínas tienen en común la capacidad de unir a β- glucanos bajo condiciones de mediana salinidad. En esta tesis se evaluó la interacción de la HDL-βGBP de plasma de camarón con vesículas lipídicas unilamelares y la actividad enzimática de la quitinasa purificada de hepatopáncreas con análogos de quitina. Los mecanismos de interacción fueron evaluados mediante ensayos fluorométricos, encontrándose que la lipoproteína agrega las vesículas sin fusión de membranas o pérdida de contenidos acuosos. Respecto a quitinasa, se detenninó la cinética de Michaelis- Menten para la hidrólisis de un análogo fluorescente, y se evalúo el efecto del pH y fuerza iónica en su actividad. La quitinas a es estable en un rango de pH 5.0-8.0 con un óptimo de actividad en pH 5.5-6.0. La fuerza iónica afectó favorablemente la actividad enzimática en el rango de 0.35-0.75 M de NaCl, mostrando estabilidad en el rango 0-1 M NaCL Los parámetros cinéticos de la enzima no son modificados por esos factores. Aún cuando la interacción con sus respectivos ligandos es diferente entre HDL-βGBP y quitinasa de camarón, se encontró que los valores de las constantes de Michaelis-Menten (Km) de quitinasa/4-metilumbeliferil-triacetilquitotriósido y de disociación (Kd) para HDL-βGBP/
laminoribiosa se encuentran en el mismo orden de magnitud. Los resultados anteriores justifican futuros estudios comparativos mediante técnicas de biología molecular, bioquímica y biofísica para profundizar en su estudio a nivel de estructura y función.
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triacetilquitotriósido y de disociación (Kd) para HDL- GBP/laminoribiosa se encuentran en el mismo orden de magnitud. Los resultados anteriores justifican futuros estudios comparativos mediante técnicas de biología molecular, bioquímica y biofisica para profundizar en su estudio a nivel de estructura y función.
SINOPSIS
La lipoproteína de alta densidad y unidora de P-glucanos HDL- GBP y la quitinasa del camarón realizan diferentes funciones. Mientras que la HDL- GBP actúa en los sistemas de transporte lipídico y de defensa del organismo; la quítinasa es una enzima necesaria en el ciclo de muda, así como en el proceso de digestión de nutrientes.
La HDL- GBP y la quitinasa, aunque tienen funciones diferentes, poseen la característica común de reconocer y unir -glucanos. La quitinasa reconoce -1,4 glucanos, mientras que la HDL- GBP reconoce -1,3 glucanos. Un aspecto interesante de estas proteínas, es la capacidad para funcionar en condiciones de alta salinidad; la HDL- GBP en hemolínfa y la quitinasa en músculo. Una pregunta lógica sería ¿qué adaptaciones sufrieron las proteínas para realizar, en tales, condiciones funciones similares a las de proteínas análogas de organismos terrestres?
En la presente tesis se planteó como hipótesis que en la interacción de HDL- PGBP con vesículas lipídicas la salinidad tiene mayor efecto que el pH, mientras en la quitinasa estos efectos son opuestos en la interacción con el sustrato. Para contrastar la hipótesis, se purificó la HDL- GBP de la hemolinfa y la quitinasa a partir de hepatopáncreas de camarón blanco (Litopenaeus vannamei). Una vez purificadas las proteínas, se evaluó el efecto de la fuerza iónica en la interacción entre HDL- GBP y
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vesículas lipídicas mediante técnicas fluorométricas. Para la enzima quitinasa, se evaluó el efecto de la fuerza iónica y pH sobre las constantes cinéticas Km y kcat·
En esta tesis, se realizó una revisión actualizada de las dos proteínas con base a su similitud en el reconocimiento de 0-glucanos (Capítulo 1). En la revisión se discute la función biológica de la HDL-PGBP y quitinasa en camarón, encontrándose que estas proteínas están relacionadas con el sistema de defensa y la nutrición. Por otro lado, aún cuando su función biológica la realizan en diferentes lugares, la síntesis de ambas se realiza en el hepatopáncreas.
Un punto abordado en la discusión del Capítulo 1, es el de las similitudes y diferencias entre la lipoproteína y la quitinasa. Se comenta que ambas poseen una composición de aminoácidos muy similar; además, la estructura primaria de la HDL- GBP presenta también regiones tipo de glucanasa. Se ha demostrado que la PGBP de Pacifastacus leniusculus, no hidroliza los -glucanos, a diferencia de la enzima quitinasa, la cual es capaz de romper el enlace -1,4 glucano. En cuanto a su estructura secundaria, ambas proteínas presentan una proporción similar de hojas tipo beta, sm embargo su plegamiento espacial se anticipa sea diferente entre ellas.
La revisión del Capítulo 1, lleva a concluir que a pesar de las diferencias en su plegamiento y la región de reconocimiento a 0-glucanos, la HDL-PGBP y la quitinasa comparten la característica de tener afinidad por 0-glucanos, con constantes de afinidad para la primera y cinéticas (K111) en la última, en el mismo orden de magnitud. Por lo
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anterior la posibilidad de estudiar estas proteínas como modelo de evolución convergente en invertebrados, mediante técnicas de biología molecular, bioquímica y biofisica, justifica ampliamente la investigación de su estructura y función.
En el Capítulo 2, se analiza la capacidad de interacción de la HDL-PGBP con vesículas lipídicas. Para determinar si esta interacción se lleva a acabo por medio de fusión de membranas o el de agregación, se utilizaron ensayos con vesículas lipídicas cargadas fluorescentemente. Los primeros ensayos realizados fueron los de pérdida de contenido acuoso o "leakage" y el de opacamiento de la fluorescencia o "quenching".
Los resultados obtenidos indicaron que la interacción entre la lipoproteína-vesículas lipídicas ocurre agregación y no por fusión de membranas. Estos resultados fueron confirmados mediante un ensayo de transferencia de energía, en el cual se utilizaron liposomas marcados con lípidos capaces de emitir fluorescencia, como se explica en el Capítulo 2. En base a estos resultados se concluye que la HDL-PGBP es una lipoproteína no fusogénica, por lo cual la interacción con vesículas lipídicas es mediada por la agregación de las mismas alrededor de la lipoproteína
En el trabajo del Capítulo 2, se analizan también los resultados de microscopía electrónica de transmisión. Se estudiaron las partículas de lipoproteína y el complejo lipoproteína-vesículas lipídicas, revelando la microfotografia que la lipoproteína posee una forma discoidal en el espacio y presenta el apilamiento de "monedas" característico de las lipoproteínas con esta morfología. Asimismo, con la microfotografía del complejo
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lipoproteína-vesículas lipídicas, se da un acercamiento de cómo se lleva a cabo esta agregación al observarse las vesículas agregadas alrededor de la lipoproteína.
La actividad de la quitinasa simulando las condiciones fisiológicas del camarón, se estudió por medio de la hidrólisis del análogo sintético de quitina, 4-metilumbeferil - N,N ,N '-triacetilquitotriosido. Este estudio está plasmado en un artículo de investigación (Capítulo 3).
La quitinasa de camarón se purificó a partir del hepatopáncreas, la cual presentó un peso molecular de :::50 kDa, estimado mediante electroforesis en gel SDS-PAGE y un pI = 4.7. Tomando en cuenta las condiciones fisiológicas a las cuales está sometida esta enzima dentro del organismo, se evaluaron lo parámetros de estabilidad a pH y pH óptimo así como estabilidad a la fuerza iónica y [Na+] óptima, utilizando diferentes buffers a una concentración 50 mM. Los resultados obtenidos mostraron que la quitinasa es estable en un rango de pH de 5.0 a 8.0 y tiene pH óptimo entre los valores de 5.5 y 6.0. Este comportamiento es similar a la quitínasa obtenida de cebada, la cual pertenece a la familia 18 de las quitinasas. La actividad de la enzima aumentó 2 10% a concentraciones de 0.35 a 0.75 M Na+ con respecto al control (O M Na+); además fue estable a la fuerza iónica cuando fue incubada a diferentes concentraciones de Na+ (0-1 M) durante 30 minutos. Estos resultados confirman la adaptación de la quitinasa a las condiciones fisiológicas del camarón.
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En el Capítulo 3 se discute también el efecto del pH y fuerza iónica en los parámetros cinéticos de la enzima quitinasa. Para ello se hicieron co1Tidas bajo diferentes condiciones (pH=6.0, O M Na+ y pH=5.5, 0.6 M Na+). Los resultados indican que la capacidad catalítica de la quitinasa no es afectada por estos factores ya que se encontró poca diferencia en las constantes Km y kcat· Asimismo, la afinidad de la quitinasa de L. vannamei, es similar en orden de magnitud a la afinidad de las quitinasas de cebada y Penaeus japonicus, así como la de HDL- GBP discutidos n el Capítulo 1.
La hipótesis establecida para el estudio sólo pudo ser evaluada para la quitinasa, encontrándose que la salinidad tiene un efecto favorable en la actividad de la enzima.
Sin embargo, la fuerza iónica y el pH no tienen un efecto significativo en las constantes cinéticas de la enzima.