Centro de lnuestigación en Hlimentación Y Desarrollo, A . C.
PURIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN PARCIAL DE LA PROTEÍNA
COAGULADORA DE LA HEMOLINFA DEL CAMARÓN BLANCO (Penaeus vannamei)
POR
KARLA MONTAÑO PÉREZ
• .
.
'.
DIRECCIÓN DE TECNOLOGÍ,I\ DE ALIMENTOS ' .
DE ORIGEN ANl�AL
COMO REQUISITO PARCIAL PARA tjBTfNER EL GRADO i¡>E
MAESTRO EN CIENC_IAS CON 1sPECIALI ¼ij, ./': ·; 11. •• ')e. ¡'
NUTRICION Y ALIMENTOS · " ··.· , • ' \,-.,,. ·,-, '----.:.
• '"''""'" tt· . -.. 10563
' ' ' ,' ..
, , • •. Fo ' i, \ ' HERMOSll O. SOIIIORA. NOVIEMBRE 04 b'E f997.- - - '
;
RESUMEN
Los mecanismos mediante los cuales un organismo se defiende contra invasores extraños y regenera tejidos dañados, están presentes de alguna manera en todos los miembros de la enorme diversidad y gran número de phyla de los invertebrados. Estos mecanismos se conocen como inmunidad natural o sistemas de defensa.
Uno de estos sistemas de defensa es la coagulación de la hemolinfa, que al igual que la coagulacion sanguínea en vertebrados, su func¡ón principal es la de evitar la pérdida de hemolinfa al sufrir una herida y obstruir la entrada de microorganismos al interior del cuerpo.
En crustáceos existe una proteína plasmática que forma pólimeros de alto peso molecular. Esta reacción es mediada por una enzima del tipo transglutaminasa, la cual es dependiente de calcio y en algunas especies se encuentra en las células sanguíneas (hemocitos).
La proteína responsable de la coagulación de la hemolinfa del camarón blanco, Penaeus vannamei, fué purificada por cromatografía de afinidad en columna de heparina-agarosa. La proteína, aquí llamada CP, fué caracterizada y reveló ser una lipoglicoproteína cuyo contenido de carbohidratos es principalmente α-D-glucosa y/o α-D-manosa, β-D- galactosamina y D-N-acetil-glucosamina. Por análisis electroforético se determinó su peso molecular de 400 kDa tanto en condiciones nativos como desnaturalizantes, sus dos subunidades idénticas unidas por puentes disulfuro mediante condiciones reductoras, la presencia de lípidos asociados y su punto isoeléctrico de 5.6.
'
Se determinó la compos,e<ón de aminoocido, encomnindosc en mayor p1oporción " ' "
,ornbmacio" de ácido glutámico )' glutamina (Glx l 1.61 mol%) y ácido a,pánico ) a,paragrn• (As, 10 19 mol%). El aminoácido menos abu"d'"" fue met;oni"a (1 38
%mol), Nos< dekrrmm\ cistei.,,.
Estos dalos se compa,aron con la composición de aaninoiicida< ea, prutelnas homologas de lango,lino Pacifasia,·e., /eniu,cul�,. langosla espino" Po"uli,--,,, im,rrup,,,, , cangrejo de arena Ow1hpcs b1pusw/a1r1s, camarón japonés Pe11aeus ¡apomcus) las tres c,denas dd fihrinógeno porcino hallándose similitud en cuanlo al porcentaje de lo, aminoáctdo, ,on,muyentcs.
Se determino la secuencia de lO aminoácidos del e.tremo ami"º terminal y se comparo con la secuencia de los orgamsmos anles m<ncwnados dando ,m SO% de sim1blud con r,mulmc< mterruprus; 70% con Pac,fasracw /em,.,rnlu.s )' 90 ¾ con P ¡apamcus
Se probó I• funcionalidad m v,frú de la protei"a por inoo<Jl0t•ci6n de dan,il-<:ad"'"i"a usando transgluoamina,a (TGa,o) de hig adu de cobayo)' ,e comprobó por ekclroforesi, 1, reacción de polimerización,
Debido o que se ,,.,. de una proteína de alto pew moleculor, se decidió ohte"er p<poido.s )' caractenzarlo, parci,lrncn1e a fin de da, el primer ¡,aso para po>tenores m,·e,tigacrnnes
<0bn: esta pro<ema en el campo de la biolog,a ,nole<ular.
('oo, este p,oposito se hicieron digestione, in"'" con Lys-f, ,., lo, labo<ato,ios de H,,,..,nl Mcmchem,st') donde se identificarun J fragmen10,. Dus de olio<><"'"""""'""' parco,lmcno,
º""'
péptido, fueron producidos durante l• redvcción con d;1;otre;1ol, CU)'OS peso, mol«ulares fueron 70, l lO, 115, 1?5 y 180 kDa. Estos péplido,, fueron reconoc;do, por los anlicuerpos pohclon,k, ,nti--CP )' por las lectinas que reconocieron al m<rnnm«o También so corrieron en 2 dimensione< sepanindolo, por punto i,ocléctrico y por peso molecular.Por Ultimo, ,e prohó la react;vidad inmunológica cruzada ontre CP )' fibrinógeno humano y ,u, respectivo, antlcuerpos policlon,k,. Se observó que hubo reconocimiento muluu.