El modo de vida de los hongos acuáticos es muy diferente al de las bacterias, ya que forman filamentos (hifas) y se reproducen mediante esporas. Desempeña un papel fundamental en la descomposición de la materia orgánica en los ríos (Pascoal y Cássio 2008). Actualmente existen técnicas alternativas que nos permiten distinguir bacterias activas de bacterias inactivas o muertas, tal y como se indica al final de la técnica.
El raspado se puede combinar con sonicación para una extracción precisa de la muestra del sustrato. Es importante utilizar siempre el mismo método de muestreo de sustrato para un estudio. Es recomendable tomar un volumen de la suspensión y diluir hasta un volumen final de 5 mL.
Las muestras deben protegerse de la luz, ya que el ergosterol puede sufrir degradación fotoquímica. Al regular las válvulas, es necesario crear un flujo uniforme y constante de disolvente a través de la columna (Figura 11.4). La concentración de ergosterol en cada muestra se calcula a partir del volumen final del extracto y el peso seco o peso seco libre de cenizas de la muestra de hoja o madera (por ejemplo, μg de ergosterol/g de peso seco).
La concentración de ergosterol también se puede expresar en función de la superficie (cm2) del sustrato analizado.
Comunidad microbiana: métodos moleculares de estudio de la diversidad
El peso seco sin cenizas de la muestra se puede determinar una vez que se completa el proceso de extracción o utilizando alícuotas de la muestra inicial. Separación basada en la secuencia característica SSCP (Polimorfismo de conformación de una sola hebra) Huellas dactilares Con digestión enzimática de ADN. Este último proporciona una separación visual de la mezcla de ADN (huellas dactilares) basada en el polimorfismo en la secuencia (DGGE, TGGE, SSCP; ver tabla 11.3) o la longitud de los fragmentos (t-RFLP, AFLP, ARISA; ver tabla 11.3) .
En caso de no realizar fraccionamiento, la filtración completa de la muestra se realiza directamente a través de un filtro de policarbonato de poro de 0,2 μm. Extracción, purificación y cuantificación de ADN Los principales pasos a realizar consisten en la homogeneización de la muestra, la disrupción celular para liberar el ADN y la eliminación de los componentes no ácidos nucleicos del extracto (proteínas, polisacáridos, etc.). Añadir 750 l de la solución de CI (cloroformo:alcohol isoamílico) y homogeneizar bien agitando, provocando que los dos medios se emulsionen.
Añadir 750 l de la solución de PCI (fenol:cloroformo:alcohol isoamílico) y homogeneizar bien agitando, emulsionando los dos medios. Al tubo Falcon 2, añadir 4 ml de la solución PCI (fenol:cloroformo:alcohol isoamílico) y homogeneizar bien agitando. Valores superiores a 2,0 indican contaminación de ARN, por lo que es recomendable incluir la lisis de este ARN mediante ARNasa en el proceso de extracción.
La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) consiste en la amplificación in vitro de secuencias específicas de ADN utilizando la actividad enzimática de la ADN polimerasa. La electroforesis en gel con gradiente químico desnaturalizante (DGGE), que generalmente utiliza urea y formamida para desnaturalizar, y su equivalente desnaturalización con gradiente de temperatura (TGGE), se utilizan habitualmente para mediciones cualitativas y semicuantitativas de la diversidad microbiana de la comunidad. En DGGE, la separación del ADN es función de las características de desnaturalización de la doble hélice del ADN.
El modelo obtenido en la DGGE proporciona una visión de la diversidad comunitaria (dactilarización). Además, se puede obtener información taxonómica eliminando bandas, reamplificándolas y secuenciando los productos de esta nueva amplificación, o mediante análisis de hibridación con oligonucleótidos marcados específicos de un taxón. Cuando el número de generaciones es grande, diferentes fragmentos de ADN pueden migrar juntos, limitando así la sensibilidad de la técnica. Retire el peine de gel y la tapa del fondo de las placas de vidrio.
El análisis de las secuencias clonadas permite la identificación de las secuencias dominantes en el producto de PCR inicial. Después de descongelarlas en un baño de hielo, se añade a estas células el producto de ligadura, que se mezcla con la propia pipeta.
Evaluación de la diversidad de los hongos acuáticos
Una vez identificadas, las secuencias con alta homología con la nuestra se importan utilizando programas como Bioedit.7 Utilizando un programa de comparación de similitud de secuencias (por ejemplo, Clustal) se determina la proximidad de la secuencia a otras en la base de datos. El uso de cebadores específicos para la región ITS del ADNr confirma que las comunidades de hifomicetos acuáticos que colonizan los sustratos de las plantas están dominadas principalmente por Ascomycota, seguida de Basidiomycota y Chytridiomycota (Bärlocher 2007). Agar agua (agar al 2% p/v en agua desionizada, autoclave, verter asépticamente en placas de Petri de 9 cm de diámetro y dejar solidificar).
Los hifomicetos acuáticos se pueden encontrar en ríos pequeños limitados por la vegetación, pero también en ríos grandes (Pascoal et al. 2005). La selección de lugares y momentos de muestreo debe realizarse de acuerdo con los objetivos del estudio y así los hongos acuáticos se pueden tomar de diferentes formas: .. a) de espumas, b) de la columna de agua, .. c) de material Planta acumulada en el lecho del río. a) Muestreo de hongos acuáticos a partir de espumas. Algunas de las espumas se pueden fijar con una punta FAA, lo que permite almacenar las muestras durante años.
Esta técnica es cuantitativa, pero tiene la desventaja de requerir un gran volumen de agua para encontrar una muestra representativa de la diversidad local. La identificación se realiza mediante un microscopio óptico con un aumento que suele variar entre 160 y 400x, según el tamaño de los conidios. Algunos hongos son difíciles de identificar basándose únicamente en el análisis de los conidios.
Para un estudio más detallado de la taxonomía, ecofisiología o toxicología de los hongos acuáticos, es preferible mantenerlos en cultivos puros. Extender una gota de la suspensión de conidias de espuma o restos vegetales en placas de petri con agua-agar. Conidios de hifomicetos acuáticos de la colección del Departamento de Biología de la Universidad de Minho (Braga, Portugal).
Monitoree los conidios liberados de cada cultivo puro durante aproximadamente dos semanas mediante observación microscópica de una gota de suspensión teñida (Figura 11.10). Las placas de agar agua restantes se pueden colocar a 8-10 ºC para detener el crecimiento de hongos. También se pueden almacenar alícuotas de cultivos en tubos de criopreservación estériles con glicerol (10-30%) y a -80 ºC.
Tasa de esporulación
Si las hojas caen constantemente, lo mejor es utilizar trampas. Pueden ser trampas de plástico colocadas directamente en el suelo o atadas entre árboles (Fig. 11.11), en las que se coloca una piedra en el centro para que las hojas se deslicen hacia abajo. él. En esta parte central se deben realizar agujeros para evitar la acumulación de agua, lo que podría afectar la calidad de las hojas. Humedece las hojas con un spray para que queden flexibles y no se fragmenten al tocarlas.
Poner las hojas dentro de las bolsas y mantener en frío hasta meterlas en el agua. Ate las bolsas en grupos de cuatro y colóquelas en las zonas de acumulación natural de hojas (fig. 11.12). Las tasas de esporulación se pueden medir después de una fecha determinada, por ejemplo una semana.
Sin embargo, para conocer el desarrollo de la actividad de los hipomicetos acuáticos se colocan varias bolsas en el río y se recogen en fechas determinadas. Saca las bolsas del agua y colócalas en una bolsa tipo Zip lock con un poco de agua de río. En el laboratorio, se lavan suavemente las hojas con agua destilada o agua de río para eliminar sedimentos o invertebrados.
Usando tijeras o una perforadora (ver Figura 11.3), corte trozos de hojas (aproximadamente 10 cm2) y colóquelos en matraces Erlenmeyer. Si no hay un agitador orbital, conecte la bomba aireadora del acuario usando una pipeta desechable de 5 ml para crear una pequeña turbulencia (ver Figura 11.8; técnica 25). Para ello, se puede mantener una temperatura similar a la temperatura del río donde se recolectó el material, o utilizar una temperatura constante cercana al promedio anual del agua del río.
Al final del período de incubación, retire los discos de hojas con unas pinzas largas y colóquelos en el horno en cajas de papel de aluminio. Las hojas se incuban en el río y posteriormente en el laboratorio en un agitador orbital. La cantidad de esporas producidas depende de las condiciones a las que están expuestas las hojas, la calidad del sustrato y el período de incubación.
Actividades enzimáticas extracelulares
Bibliografía
Use of solid phase extraction to determine ergosterol concentration in fungal colonized plant tissue. An illustrated guide to aquatic and aquatic hyphomycetes (Fungi imperfecti) with notes on their biology.
