13 Protocolo de almacenamiento in vitro en condiciones mínimas de crecimiento de Bletia purpurea (Lam.) y evaluación de la estabilidad genética. Con el objetivo de crear condiciones mínimas de crecimiento para la preservación in vitro del germoplasma de B.
INTRODUCCIÓN
Para lograr esto se cambia la composición del medio de cultivo, como reducir el contenido de minerales y la fuente de carbono, entre otros (Rayas et al., 2002). 5 se utilizan para analizar la estabilidad genética in vitro en Curcuma longa (Tyagi et al., 2007), Billbergia rosea (Pardo et al., 2008) y fresa (Hassan y Bekheet, 2008), entre otras especies.
ANTECEDENTES
ORQUÍDEAS DE MÉXICO
11 Aunque la familia de las orquídeas es una de las más grandes, su población ha disminuido significativamente, estos cambios se deben principalmente al cambio y destrucción del hábitat y muchas de las poblaciones silvestres se han visto seriamente afectadas por el volumen de individuos que se eliminan para satisfacer el comercio de demanda que están sujetos a ella por ser especies altamente valoradas como ornamentales. Lo anterior resulta en una recuperación poblacional lenta o inexistente debido a que tienen una baja tasa de crecimiento, ciclos de vida relativamente largos y poco reclutamiento de nuevos individuos en condiciones naturales, provocando que un gran número de ellos se encuentren en peligro de extinción (UICN/Orchid Specialist Group SSC 1996 ; Sosa y Platas, 1998; Ávila y Oyama, 2002). En una gran cantidad de mercados públicos a lo largo de México existe una venta masiva de individuos recolectados ilegalmente, donde es posible encontrar especies en peligro de extinción, por lo que esta actividad se ha convertido en una de las principales causas de la disminución en el número de individuos y poblaciones de especies de orquídeas mexicanas (Hágsater y Soto, 2001; Salazar, 2003).
En otros casos, el poco conocimiento que la gente tiene sobre el cultivo de plantas hace que sea casi imposible sobrevivir.
ORQUIDEAS NATIVAS DE LA PENÍNSULA DE YUCATÁN
12 especies, restauración de hábitat, control de especies invasoras y manejo de poblaciones de plantas y ecosistemas; Sin embargo, si lo anterior no puede llevarse a cabo con éxito, o si se pretende potenciar los esfuerzos realizados, se puede recurrir a la conservación ex situ; En este sentido, los jardines botánicos y otras instituciones de investigación tienen una función importante: intentan salvar germoplasma en peligro manteniendo colecciones vivas, estableciendo bancos de semillas, suministrando material para diversos fines para eliminar la presión de recolección a la que están sujetos o reducir, y la cultivo de plantas. aquellas especies con semillas recalcitrantes que no pueden mantenerse en bancos de semillas y mediante propagación, multiplicación y conservación mediante técnicas de cultivo de tejidos (Tinoco y Mata, 2007). 13 inmensas extensiones de bosque tropical, cuya composición florística depende fuertemente de la precipitación anual, dando como resultado bosques bajos y medios así como bosques altos. Otra razón importante por la que este estado es particularmente importante es que, entre todos los estados de la República Mexicana, Campeche tiene el porcentaje más alto de su territorio (alrededor del 30%) bajo el estatus de áreas protegidas (Sánchez et al., 2002).
Dentro de la Península de Yucatán en general y en el estado de Campeche en particular, se encuentra Bletia purpurea (Lam.), una orquídea terrestre considerada en peligro de extinción, principalmente por las amenazas de la urbanización y el cambio de su hábitat; La disminución de sus poblaciones hace necesario buscar alternativas para su conservación (Dutra et al., 2008).
GENERO BLETIA RUIZ Y PAVÓN Subfamilia: Epidendroideae Lindley
En otras palabras, Campeche ofrece una gran variedad de ecosistemas, la mayoría de los cuales tienen una alta capacidad para la reproducción natural de especies silvestres (Sánchez et al., 2000). Columna: alargada, en forma de semitorque, alada, casi siempre con dos aurículas en la base, sin pie o con pie corto; la antera está operculada y envainada; con ocho polinios céreos (Sánchez et al., 2002). Son originarias de América, extendiéndose desde Florida y México, donde está su centro de distribución, hasta Brasil (Sánchez et al., 2002).
Bletia contiene un buen número de especies terrestres exuberantes y hermosas, aunque rara vez pueden ser poliepifíticas o litofíticas (Sánchez et al., 2002).
BLETIA PURPUREA (LAM.) DC
Existen dos estrategias básicas para la conservación del germoplasma vegetal, la conservación in situ y la conservación ex situ (Nodarse et al., 1998). En la conservación in situ, las especies se mantienen en su hábitat natural, generalmente en parques nacionales, reservas biológicas y reservas ecológicas. Mientras que las especies en conservación ex situ se conservan fuera de su hábitat natural, en bancos de semillas botánicos, bancos de plantas en campo o bancos de plantas in vitro (García et al., 2007).
Desde entonces, la conservación in vitro de germoplasma vegetal ha sido una herramienta de trabajo que apoya la conservación de semillas botánicas y la conservación de campo al permitir duplicados seguros de aquellos genotipos de particular interés (Engelmann y Takagi, 2000).
17 Esta ruta de conservación se puede realizar mediante dos métodos: crecimiento mínimo y criopreservación. El método basado en crecimiento mínimo es el más generalizado, se basa en la modificación de las condiciones óptimas de crecimiento, para reducir la velocidad normal de crecimiento de las especies en estudio, reduciendo así la frecuencia de traslado de las plantas a cultivo medio fresco (García et otros, 2007). A mediados de los años 90 del siglo XX, la conservación del germoplasma vegetal implicaba también la inmersión directa de los explantes en nitrógeno líquido (criopreservación) y dentro de este método de conservación, el procedimiento de vitrificación era el más eficiente y utilizado por muchos autores (Hirai y Sakai , 2003); Wang y Deng, 2004; Caccavale et al., 2005).
MÉTODOS DE CONSERVACIÓN IN VITRO
Gracias al crecimiento mínimo, la criopreservación in vitro garantiza la conservación por períodos más prolongados (García et al., 2007).
MÉTODO DE CRECIMIENTO MÍNIMO
La relación entre la concentración de carbohidratos y los componentes nitrogenados del medio nutritivo puede tener efectos sobre las tasas de crecimiento y la morfogénesis en cultivos in vitro (Staritsky, 1980; Rayas et al., 2002). La adición de osmótico al cultivo ha demostrado ser eficaz para reducir el crecimiento y aumentar la vida útil de muchos tejidos cultivados in vitro a partir de diferentes especies de plantas. Se ha informado que el manitol, la sacarosa y principalmente el sorbitol son osmóticos que aumentan la vida útil de almacenamiento de los tejidos in vitro (Shibli et al., 2006).
Se han registrado alrededor de 37.600 muestras para su conservación utilizando técnicas in vitro en bancos de germoplasma de todo el mundo (FAO, 1996).
APLICACIONES DEL MÉTODO DE CRECIMIENTO MÍNIMO
La modificación en la composición del medio de cultivo es una forma de limitar el crecimiento, por ejemplo, el crecimiento in vitro de las plantas de yuca disminuyó proporcionalmente al contenido total de nitrógeno del medio de cultivo. Los mejores resultados se obtuvieron en un medio de cultivo que contenía al menos 20 g/L de sacarosa y una temperatura de crecimiento de 20 °C. En este sentido, Roca et al. 1994) describe: "El material recuperado de la conservación in vitro debe ser genéticamente representativo del material utilizado, y cualquier sistema de cultivo in vitro será inaceptable si presenta un alto riesgo de inestabilidad genética o selección entre genotipos, o ambas".
Algunos factores externos son: método de cultivo in vitro y patrón de desarrollo, edad del cultivo y subcultivos y algunos componentes del medio de cultivo (Sánchez-Chiang y Jiménez, 2009).
MARCADORES MOLECULARES BASADOS EN ADN
- MARCADORES MOLECULARES BASADOS EN PCR
A continuación, los fragmentos de ADN se separan según su movilidad electroforética y se visualizan en un gel de agarosa o poliacrilamida (Hames y Rickwood, 1990, Williams et al., 1990). Las diferencias en el patrón de bandas detectadas entre individuos indican diferencias en su secuencia de bases (Picca et al., 2004). Esta técnica es sencilla y eficaz y permite determinar polimorfismos en un gran número de muestras (Martín et al., 2002).
Como aplicaciones del método RAPD, Williams et al. 1990) proponen el desarrollo de mapas genéticos, aplicaciones reproductivas en plantas y animales, y como productores de marcadores moleculares en estudios de genética de poblaciones.
HIPOTESIS Y OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
MATERIALES Y MÉTODOS
- COMPOSICIÓN BÁSICA DE LOS MEDIOS DE CONSERVACIÓN EN CRECIMIENTO MÍNIMO Y CONDICIONES DE CULTIVO
- CULTIVO EN CONDICIONES DE CRECIMIENTO MÍNIMO
- EXTRACCIÓN DE ADN
- SELECCIÓN DE OLIGONUCLEÓTIDOS
35 La estrategia experimental para la conservación in vitro de la orquídea Bletia purpurea (Lam.) se muestra en la Fig. exponer. Para estudios de crecimiento mínimo se utilizaron brotes de Bletia purpurea (Lam.) de 3 meses de edad obtenidos de germinación in vitro de semillas.
Para el análisis de estabilidad genética, se tomaron al azar los brotes obtenidos de la regeneración de los cultivos de crecimiento mínimo de los tratamientos 2 (75% MS, 1% sacarosa) y 4 (75% MS), en tres tubos de cultivo diferentes. % sacarosa) y como control (T) se utilizaron brotes in vitro no conservados.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Después de 6 meses de conservación in vitro (Fig. 6), el ANOVA (Cuadro 13) mostró diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos debido al efecto de la disminución de la fuerza iónica de las sales de MS, de la sacarosa y de la interacción MS- sales y sacarosa (P<0.05). Paretograma de los efectos de la disminución de la fuerza iónica de las sales de MS y de la concentración de sacarosa sobre el número de brotes después de 6 meses de conservación de B. Gráfico de los principales efectos: disminución de la fuerza iónica de las sales de MS y concentración de sacarosa, sobre el número de brotes después de 6 meses de conservación de B.
Protocolo establecido para la conservación in vitro en condiciones mínimas de crecimiento de Bletia purpurea (Lam.) y evaluación de la estabilidad genética.
CONCLUSIONES
Los tratamientos elegidos para la conservación del germoplasma de Bletia purpurea en condiciones mínimas de crecimiento fueron el tratamiento 2 formulado con 75% MS más 1% sacarosa y el tratamiento 4 compuesto por 75% MS más 3% sacarosa. Utilizar el protocolo establecido de crecimiento mínimo permitirá almacenar germoplasma de Bletia purpurea (Lam.) a un menor costo, contribuyendo así a la conservación de esta especie. Los brotes recuperados luego de 6 meses de preservación en medio mínimo de crecimiento no perdieron su capacidad regenerativa y lograron multiplicarse normalmente sin mostrar variaciones en sus patrones electroforéticos en comparación con los brotes no sometidos a condiciones de preservación.
El protocolo descrito en este estudio fue efectivo para mantener un crecimiento mínimo in vitro de B.
RECOMENDACIONES
71 Para futuras investigaciones, se recomienda tomar como referencia los resultados aquí reportados para diseñar una metodología que incluya la evaluación de un tratamiento sin fuente de carbono, así como el uso de otros agentes osmóticos como manitol y sorbitol y extender el período de almacenamiento de B Se recomienda el uso del ensayo RAPD como herramienta útil para estudiar la estabilidad genética durante la conservación in vitro dentro de la familia Orquidaceae. La preservación in vitro de germoplasma tiene muchas ventajas, pero hay que tener en cuenta que siempre existen riesgos derivados de fallas en los equipos y contaminación de los medios por falta de control, por lo que se deben tomar las medidas necesarias para evitar daños al germoplasma. germoplasma.
BLIBLIOGRAFIA
Conservación in vitro de germoplasma de Musa: efectos del manitol y la temperatura sobre el crecimiento y el almacenamiento. Establecimiento de condiciones mínimas de crecimiento para la conservación in vitro de germoplasma de chile habanero (Capsicum chínense Jacq.). Micropropagación y conservación in vitro de seis especies del género Limonoium endémicas de la Península Ibérica.
Low cost media for in vitro storage of turmeric (Curcuma longa L.) and assessment of genetic stability using RAPD markers.
