Para la reproducción parcial o total de la tesis con fines académicos se deberá obtener autorización escrita del director del Centro de Investigación y Desarrollo de Alimentos A.C. Me gustaría agradecer a mi comité de tesis, Dr. Irasemi Vargas Arispuro, Ph.D. María Auxiliadori Islas Osuna y dr. Alejandro Falcón Rodríguez, por su disposición y atención en la revisión de la tesis y por su asesoramiento y apoyo durante el desarrollo del trabajo de investigación. Gabriel Iván Romero Villegas, primero por recomendarme comenzar a trabajar en el laboratorio antes de iniciar mis estudios de Maestría y segundo por brindarme apoyo y amistad desde mi trayectoria en el ITSON hasta ahora.
A todos los investigadores que presentaron las materias que tomé durante el transcurso de la maestría, gracias por su tiempo y los consejos brindados. 29 Evaluación de la expresión de genes relacionados con la defensa en trigo (Triticum aestivum L.) mediante aplicación foliar y adición al sustrato. 2 Diseño de cebadores utilizados para la expresión de genes de defensaDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDDD 24 3 Composición iónica asignada de oligosacáridos de quitosano por el.
LISTADO DE ABREVIATURAS
RESUMEN
INTRODUCCIÓN
Estos compuestos inducen una respuesta oxidativa y de señalización en la célula huésped, como los radicales hidroxilo (-OH), el anión superóxido (O2‾) y el peróxido de hidrógeno (H2O2) (Zhao et al., 2005). El aumento de ROS constituye una señal que activa la expresión de genes tempranos involucrados en su desintoxicación y en la producción de sustancias antimicrobianas, como las fitoalexinas, material para la producción de ligninas y fortalecimiento de la pared celular (Torres et al., 2006). . Las proteínas PR incluyen enzimas hidrolíticas como quitinasas y β-1-3-glucanasas (Aziz et al., 2004; Falcón-Rodríguez et al., 2009).
Los autores han informado que promueve el crecimiento de las plantas, inhibe el desarrollo de microorganismos e induce resistencia en las plantas a patógenos (Bautista-Baños et al., 2006). En las plantas de tabaco se ha estudiado de cerca la activación de enzimas relacionadas con esta defensa contra oomicetos fitopatógenos del género Phytophthora (Falcón-Rodríguez et al., 2011). Estas reacciones y activación génica pueden verse influenciadas en mayor o menor medida por la acetilación (GA) del compuesto, así como por el grado de polimerización (GP) (Falcón-Rodríguez et al., 2011; Khan et al., 2003). ).
ANTECEDENTES
Además de las infecciones en la etapa de plántula, pueden provocar su muerte (Roelfs et al., 1992). De los trabajos realizados en campo se destacan aquellos donde se logró reducir la ocurrencia de roya del café (provocada por Hemileia vastatrix) con aspersiones mensuales de conidios de Verticillium lecanii (Carrión et al., 1992). Recientemente se estudió el efecto de la aplicación de derivados del quitosano en plantas de tabaco (Nicotiana tabacum) y se encontró que la naturaleza química y la longitud del polímero afectan la respuesta defensiva (Falcón-Rodríguez et al., 2009).
Activación de vías metabólicas en la célula vegetal tras la detección de inductores biológicos (García-Brugger et al., 2006). Estos ácidos son polisacáridos gelificantes que constituyen una fracción homogénea de las pectinas ubicadas en la matriz extracelular del tejido blando del fruto (Riveros, 2010; Cartaya et al., 2009). 1 en la actividad PAL inducida antes de la cosecha en frutos de uva y en la disminución de la infección por patógenos (Meng et al., 2008).
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
MATERIALES Y MÉTODOS
Las condiciones para la hidrólisis fueron 24 horas a una temperatura de 37ºC y pH 5, a partir de una solución de quitosano al 1% en tampón acetato establecida por Cabrera y Van-Cutsem (2005). Una vez transcurrido el tiempo de hidrólisis, se detuvo la reacción esterilizando las soluciones en autoclave, seguido de precipitación de los oligosacáridos a pH 7,5 con KOH y lavado con metanol al 90% (v/v). Se realizaron dos pruebas (Figura 6) para evaluar el efecto de los tratamientos con polímeros y la mezcla de quitosano-oligosacárido sobre la inducción del sistema de defensa de la planta de trigo.
Se recogieron hojas de trigo a las 0, 6 y 12 h después de la aplicación del polímero y a las 0, 3, 6 y 12 h después de la aplicación de oligosacáridos, luego se realizaron análisis de expresión génica. Para la extracción de ARN total se utilizaron 100 mg de hojas de trigo tratadas con quitosano y la mezcla OLG, las cuales fueron molidas con N2 líquido inmediatamente después del corte. Para la extracción de ARN total se utilizó el kit comercial Concert Plant Reagent®, siguiendo las especificaciones del proveedor.
Luego, el ARN se trató con la enzima ADNasa I (Ambion) para eliminar el ADN genómico y realizar la síntesis de ADNc. Después de obtener el ARN total y eliminar el ADN genómico, se procedió a la síntesis de ADNc utilizando el kit de reactivos comercial SuperScript® First-Strand (Invitrogen, EE. UU.). Con estos reactivos se sintetizó ADN monocatenario complementario utilizando la enzima transcriptasa inversa.
Las diferentes incubaciones de las muestras fueron las siguientes: a 65 °C durante 5 min para romper la estructura secundaria del ARN, 42 °C/50 min para la transcriptasa inversa, 70 °C/15 min para detener la reacción de la transcriptasa y 37 °C/ 20 min para digerir el ARN del híbrido ARN-ADN. 25 inmediatamente en la amplificación y expresión de genes de defensa en reacciones de PCR. Los genes se amplificaron mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) utilizando cebadores específicos para cada gen.
El análisis de la expresión génica se realizó de forma semicuantitativa mediante densitometría utilizando el software Kodak-Image 100 Lab.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Evaluación de la expresión génica relacionada con la defensa en trigo (Triticum aestivum L.) mediante aplicación foliar y adición. La Figura 11 muestra la expresión relativa de PAL en hojas de trigo en diferentes momentos de muestreo, antes de la aplicación (hora 0) y a las 6 y 12 horas después de la aplicación. Se observó un efecto de la aplicación foliar de quitosano sobre los niveles de expresión del transcrito PAL 6 horas después de la aplicación del tratamiento en comparación con el control, donde se encontraron diferencias significativas (p<0.05) para la concentración de 0.1g*L-1.
También se observó un efecto (p<0.05) en la expresión de PAL en hojas de trigo 6 h después de aplicar quitosano al sustrato (Figura 11B) a la concentración más alta en este estudio (1g*L-1). Después de este tiempo, los niveles de expresión PAL volvieron a sus niveles originales, tal como lo hizo por el efecto de la aplicación foliar. Estos resultados muestran un efecto inductor del polímero de quitosano independientemente de la forma de aplicación y la percepción del compuesto en la planta.
Por otro lado, también participa en la síntesis (vía ácido benzoico) de ácido salicílico, el cual ha sido considerado una señal importante en la amplificación de la respuesta de defensa sistémica en las plantas (Dixon et al., 2002; Ribnicky et al. Cuando la mezcla de oligosacáridos de quitosano se aplicó foliar a las plantas y se agregó al sustrato (Figura 12), el muestreo se realizó a las 0, 3, 6 y 12 horas después de la aplicación con los tratamientos, la aplicación foliar (Figura 12A) no fue un tratamiento efectivo (p> 0.05) en la inducción de PAL en cada momento de muestreo, sin embargo, se observó que al aumentar la concentración de
Por lo tanto, no hubo inducción de la expresión de PAL, que es precursora de la síntesis de estos compuestos; Se han reportado informes similares para estudios con células de soja (Day et al., 2001). La Figura 15 muestra la expresión relativa del gen quitinasa debido a la aplicación de quitosano a concentraciones de 0.1 y 1g*L-1 en dos formas de aplicación (foliar y adición al sustrato) evaluadas a las 0, 6 y 12 horas. Cuando se agregó quitosano al sustrato, los cambios en la expresión genética resultaron de la inducción de defensas sistémicas, ya que el inductor solo estaba en contacto con la raíz.
En trabajos realizados en hojas de tabaco utilizando oligosacáridos de quitosano como inductor de respuestas de defensa se observó un aumento en los genes PAL, QUIT y GLU desde la primera hora de muestreo hasta 8 horas después de la aplicación (Yafei et al., 2009). 47, donde se observó estimulación de la actividad quitinasa a las 6 horas de la aplicación, alcanzando la actividad máxima a las 12 y 24 horas. Mejora de la expresión de genes de defensa utilizando quitosano y oligosacáridos de quitosano.
CONCLUSIÓN
RECOMENDACIONES
BIBLIOGRAFÍA
Characterizing the diffusion of non-electrolytes through the plant cuticle: properties of the lipophilic pathway. Preparation of chitooligosaccharides with a degree of polymerization higher than 6 by acid or enzymatic degradation of chitosan. Verticillium lecanii Organic Coffee Control In Memorias del VI Congreso Latinoamericano de Fitopatología.
Oligoglucans as stimulators of the enzymatic antioxidant system in zucchini (Cucurbita pepo L.) seedlings at low temperature. The concentration and physicochemical properties of chitosan derivatives determine the induction of defense responses in roots and leaves of tobacco plants (Nicotiana tabacum). Effect of size and degree of acetylation of chitosan derivatives on the protection of tobacco plants against Phytophthora parasitica nicotianae.
Estudio de la actividad antibacteriana de películas elaboradas con quitosano de diferentes pesos moleculares incorporando aceites esenciales y extractos de hierbas como agentes antimicrobianos. El grado de polimerización y N-acetilación del quitosano determina su capacidad para inducir la formación de callosa en células en suspensión y protoplastos de Catharanthus roseus. Efecto del quitosano sobre la inducción de la actividad de enzimas relacionadas con la defensa y protección de plántulas de arroz (Oryza sativa L.) contra Pyricularia grisea Sacc.
Correlación entre la resistencia en plántulas y la resistencia en plantas adultas a la roya amarilla y al tizón de la cebada. Comparación de la capacidad de los quitosanos y quitooligosacáridos parcialmente N-acetilados para inducir respuestas de resistencia en hojas de trigo. Análisis de virulencia de la roya de la hoja (Puccinia triticina Ericks.) del trigo (Triticum aestivum L.) en los valles altos de México.
Extraction and precipitation of chitosan from the cell wall of zygomycetes fungi with dilute sulfuric acid.
ANEXOS
3 AG---TACATTATAG---CTGCTGCTTCGATCGATC--- 1093 5 TTCATGCAT-ACAA--- TACATATAG---CTGCTGCTTCGATCGATC--- 1150 2 TTCATGTATTACAA---TACATTAC---CTGCTGCTTCGATCGATC.