9 Figura 4. Ejemplar de herbario de la planta Chan (Hyptis suaveolens L. Poit.) depositado en el herbario del Biólogo Jorge Espinoza Salas de la Universidad Autónoma Chapingo. Procedimiento para la obtención de extractos de diferente polaridad a partir de hojas de Chan (Hyptis suaveolens L. Poit.). Patrón de bandas obtenido utilizando el iniciador ISSR10 en 88 colecciones de pasto Chan (Hyptis suaveolens L. Poit.).
Evaluación de toxicidad (CL50) de extractos de Hyptis suaveolens utilizando el modelo de Artemia salina. Los marcadores moleculares ISSR han demostrado ser una herramienta útil en el estudio de la variabilidad genética presente en poblaciones de la planta Chan (Hyptis suaveolens L. Poit.).
INTRODUCCIÓN
OBJETIVOS
HIPÓTESIS
REVISIÓN DE LITERATURA
- Diversidad de la familia Lamiaceae
- Importancia de la familia Lamiaceae en México
- La hierba de Chan (Hyptis suaveolens L. Poit)
- Nombres comunes
- Origen y distribución
- Composición química de Hyptis suaveolens
- Usos principales
- Marcadores moleculares
- Uso de los marcadores moleculares
- Principales marcadores moleculares
- Métodos de limpieza de ADN
- Uso de plantas medicinales
- Extractos de plantas medicinales
- Métodos de extracción de componentes bioactivos de plantas
- Toxicidad en plantas medicinales
Bangladesh, China e India en Asia; Benin, Kenia, Nigeria, Sudán y Camerún en África (Ngozi et al., 2014). Estas columnas están disponibles comercialmente para la purificación de moléculas pequeñas (por ejemplo, fragmentos de PCR, plásmidos) o ADN genómico adecuado para diversas aplicaciones (Tagliavia et al., 2009). Si es posible, la extracción debe realizarse en condiciones suaves utilizando disolventes de baja reactividad (Hamidi et al., 2014).
Por ello, se están realizando investigaciones con el objetivo de determinar la toxicidad de las plantas medicinales además de la acción farmacológica (Fernández-Calienes et al., 2009). Esta correlación significativa permite el uso de este bioensayo como una herramienta útil en el descubrimiento de fármacos antitumorales (Arcanjo et al., 2012).
MATERIALES Y MÉTODOS
- Identificación taxonómica
- Colecta de materiales
- Caracterización molecular
- Limpieza y almacenamiento del material vegetativo
- Extracción de ADN
- Medición de la cantidad y pureza del ADN
- Amplificación del gen 16s
- Fenolización de la solución de ADN
- Purificación de ADN mediante columnas
- Obtención de patrones ISSR
- Evaluación de la toxicidad de extractos
- Colecta y secado de material vegetativo
- Preparación de extractos
- Partición de extractos
- Eclosión de Artemia salina
- Concentraciones de extractos evaluados
- Evaluaciones de toxicidad
- Análisis estadístico
Luego de pesado el material vegetativo, se colocó en bolsas plásticas y se almacenó en un congelador a -50°C para su posterior análisis. Luego los tubos se colocaron en un termobloque (Thomas Scientific, EE. UU.) a 65 °C durante 20 min, luego de lo cual se retiraron del termobloque y se colocaron en una centrífuga FRONTIERTM 5515 (OHAUS, EE. UU.), donde se centrifugaron a 21.000 xg. . durante 10 minutos. Luego se preparó un gel de agarosa al 1,8%, para lo cual se pesaron 2,16 g de agarosa y se colocaron en un matraz Erlenmeyer, luego se agregaron al matraz 120 mL de 1x TAE y se agitó suavemente.
Luego se retiró el gel de la cámara de electroforesis y se tiñó en bromuro de etidio durante 15 minutos, después de lo cual se fotodocumentó en un transiluminador DigiDoc-it (UVP, EE. UU.). Los microtubos se colocaron en un termociclador Techne TC-412 (Bibby Scientific, EE.UU.) programado con las temperaturas y tiempos que se muestran en la Tabla 3. La solución de ADN correspondiente a cada muestra se colocó en un tubo Eppendorf y se añadió agua grado biología molecular hasta alcanzó un volumen de 400 µL.
Se preparó una mezcla de reacción 90x para cada iniciador colocando en un tubo Eppendorf de 1,5 mL los reactivos presentados en la Tabla 4. Los microtubos que contenían un volumen final de 25 μL se colocaron en un termociclador, el cual se programó con las temperaturas y tiempos que se muestran en la Tabla 5. La fase acuosa se devolvió al embudo de decantación, mientras que la fase de hexano se depositó en un rotavapor para separar el hexano por un lado y el extracto de hexano por el otro.
El hexano recuperado se devolvió al embudo de decantación y se volvió a mezclar con la fase acuosa, mientras que el extracto de hexano se depositó en un material refractario. El extracto de hexano se raspó con una espátula, se pesó y se colocó en un frasco color ámbar que se conservó en refrigeración. Finalmente, la fase acuosa se retiró del embudo de decantación y se vació en un refractario, que se colocó en una campana extractora para eliminar toda el agua, usando presión de vapor normal.
Los quistes de Artemia salina utilizados en este trabajo se adquirieron en un acuario. Se tomaron 0,5 ml de cada tratamiento y se colocaron en un vial de vidrio, considerando tres réplicas para cada concentración.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Análisis de agrupamiento
Dendrograma construido a partir de la distancia del cubo (1 – S) y el método de agrupamiento de varianza mínima de Ward de 9 poblaciones de Hyptis suaveolens colectadas en el Istmo de Tehuantepec, Oaxaca. Los resultados obtenidos en el presente trabajo son consistentes con lo establecido por Sharma y Raghubanshi (2009) y Saha et al. 2017), quienes encontraron que el pasto Chan es una especie altamente adaptable en la naturaleza y ampliamente distribuida geográficamente debido a su alta plasticidad fenotípica que le permite colonizar con éxito áreas ambientalmente diversas.
Análisis Coordenadas Principales
Los resultados obtenidos en este trabajo están de acuerdo con lo encontrado por Sharma y Raghubanshi (2009) y Saha et al. 2017), quienes encontraron que el pasto Chan es una especie altamente adaptable en la naturaleza y geográficamente extendida debido a su alta plasticidad fenotípica, lo que le permite colonizar exitosamente áreas ambientalmente diversas. análisis de agrupamiento realizado previamente. La variabilidad genética presente en ambos grupos podría aprovecharse para iniciar un programa de mejoramiento genético para obtener híbridos en esta especie vegetal, ya que, como menciona Groszmann et al. 2010) el alcance de la heterosis esperada dependerá directamente de la distancia genética entre los padres del híbrido. Diagrama de dispersión obtenido del análisis de coordenadas principales de 9 poblaciones de Hyptis suaveolens con distancias Dice (1 – S) utilizando 10 marcadores moleculares tipo ISSR.
Análisis Molecular de Varianza (AMOVA)
Diagrama de dispersión obtenido del análisis de las coordenadas principales de 9 poblaciones de Hyptis suaveolens a partir de las distancias al cubo (1 - S) utilizando 10 marcadores moleculares tipo ISSR. preservación de esta variabilidad genética, ya que como mencionan Szczecińska et al. 2016) se debe identificar la diversidad genética dentro y entre poblaciones para seleccionar las poblaciones responsables de la mayor parte de la variación existente. Si la variación genética se encuentra principalmente dentro de una población, se requieren menos poblaciones para proteger y mantener la variación general en todo el rango geográfico de una especie determinada. La extensa variación genética que existe en las poblaciones analizadas de la planta Chan se debe en gran medida a que estas poblaciones son completamente silvestres, por lo que, después de no haber sido mejoradas genéticamente, aún conservan una amplia variabilidad.
Otro factor que sin duda afecta la variabilidad genética son las mutaciones espontáneas que se presentan en las poblaciones (Gadidasu et al., 2011), así como el sistema reproductivo alógamo que presenta esta especie (Saha et al., 2017).
Descriptiva de marcadores
BP=Número de bandas polimórficas; BM=Número de generaciones monomorfas; BT=Número de generaciones totales; PMF=Proporción de loci polimórficos; PIC=Contenido de Información Polimórfica; S.E.=PIC de error estándar; AMP=Porcentaje de amplificación;. Los cebadores que amplificaron más bandas fueron el cebador ISSR3 (18 bandas) con un 22,35% de amplificación en las 88 muestras, así como el ISSR7 (18 bandas) con un 20,64% de amplificación. Los valores más altos de información polimórfica (PIC) se obtuvieron con los cebadores ISSR4, HY8, ISSR2, ISSR10 (Figura 6) y HY6, lo que indica que estos cebadores son los más informativos y pueden considerarse muy útiles en estudios posteriores de caracterización en esta especie vegetal. .
Los resultados obtenidos en el presente estudio son consistentes con los obtenidos por Gadidasu et al. 2011), quienes encontraron que los marcadores HY8, ISSR10 y HY6 fueron los marcadores que mostraron los valores de PIC más altos en las poblaciones de pasto Chan indio. La probabilidad más baja de que dos individuos compartan coincidentemente el mismo alelo (PDICMA) se obtuvo mediante los cebadores ISSR9, UBC823, ISSR3 e ISSR10, lo. Los resultados también muestran que el cebador UBC823 fue el que mostró menor poder discriminatorio, así como menor contenido de información polimórfica.
Los resultados obtenidos en este trabajo muestran que, como informaron previamente Feitosa-Alcantara et al.
Índice de diversidad de Shannon-Weaver
Por otro lado, la menor variabilidad genética que representan las poblaciones de plantas Chan del Municipio 3 (Reforma de Pineda) puede deberse en parte a las prácticas agrícolas, especialmente el control de malezas, ya que la planta Chan todavía se considera una maleza en muchas partes del país (Ortega -Acosta et al., 2020), por lo que es común eliminarlo en etapas tempranas del desarrollo, interrumpiendo el flujo de información genética y con ello reduciendo la variabilidad presente en las poblaciones.
Evaluación de toxicidad de extractos
Otros investigadores que realizaron pruebas para evaluar la actividad insecticida de los extractos de hojas de Chan contra el hongo de la harina parda (Tribolium castaneum) encontraron que el extracto de éter de petróleo de las hojas presentó una DL50 de 2.647 mg cm2 a las 48 horas y esta fue tres veces superior a la efectiva. . que el extracto de raíz de cloroformo (Hasan et al., 2018). Durante mucho tiempo se han realizado pruebas para medir la toxicidad de diversos extractos de plantas y aceites esenciales utilizando el modelo de Artemia salina (Budaraga et al., 2016) y han contribuido significativamente a la determinación de la toxicidad de un gran número de especies de plantas. en todo el mundo (Fernández-Calienes et al., 2009; Hamidi et al., 2014; Aranda-Ventura et al., 2018). La mayoría de las plantas medicinales se recolectan de la naturaleza y solo el 15% se cultiva (Palma-Tenango et al., 2017).
Por tanto, el mejoramiento genético de la gran cantidad de plantas medicinales que existen en nuestro país representa actualmente un amplio área de investigación, lo que permitiría incrementar el subconjunto útil de plantas que existen actualmente en torno a las plantas medicinales. Los marcadores moleculares tipo ISSR resultaron efectivos para el estudio de la variabilidad genética presente en poblaciones naturales de la planta Chan (Hyptis suaveolens L. Poit.). Las poblaciones de pasto Chan de la zona del Istmo de Tehuantepec en el estado de Oaxaca exhiben una alta variabilidad genética que podría ser útil en futuros programas de mejoramiento de esta especie medicinal.
Todos los extractos de etanol y acetato de etilo se obtienen de las hojas de la planta Chan (Hyptis suaveolens L. Poit.). Evaluación de la bioactividad de plantas medicinales cultivadas en el Perú mediante la prueba de mortalidad de Artemia salina. Composición química y evaluación toxicológica de Hyptis suaveolens (L.) Poiteau (LAMIACEAE) en Drosophila melanogaster y Artemia salina.
Evaluación de la toxicidad de extractos de plantas cubanas con posible actividad antiparasitaria utilizando larvas de Artemia salina L. Parientes silvestres del tomate como fuente de germoplasma para el mejoramiento genético de la especie. 2019.Investigación química de la semilla de Hyptis suaveolens, un potencial agente nutracéutico antihiperuricémico, mediante HPLC-SPE-NMR.
Los marcadores ISSR revelan polimorfismo genético en dos variantes morfológicas de Hyptis suaveolens invasora en la India. Composición química y actividad antibacteriana del aceite esencial de Hyptis suaveolens (L.) Poit. Lamiaceae) de las tierras bajas de Venezuela.