Los miembros del comité designado para revisar la tesis de Deyanira Fimbres García la consideraron satisfactoria y recomendaron aceptarla como requisito parcial para obtener el grado de Maestría en Ciencias. Para la reproducción parcial o total de la tesis con fines académicos se deberá obtener autorización escrita del Director General del CIAD. Aldo Arvizu de la Universidad de Sonora, por su ayuda en el modelado de la estructura y purificación de la proteína.
El objetivo de este trabajo fue determinar las características bioquímicas y modelar la estructura tridimensional de la enzima DHAR del mango (MiDHAR). A partir de la secuencia de aminoácidos de MiDHAR, se obtuvo un modelo estructural por homología de la enzima, utilizando la estructura cristalina recientemente reportada del DHAR de arroz (OsDHAR) (PDB: 5D9W), y se identificaron los posibles aminoácidos del sitio catalítico.
INTRODUCCIÓN
2, donde realiza su función y así mantiene niveles reducidos de AsA en la célula.
ANTECEDENTES
- Factores de Estrés Causantes de Daño Celular en Plantas
- Sistema Antioxidante en Plantas Como Respuesta a Daño por Estrés…
- Ciclo Ascorbato-Glutatión, Proceso Clave Para el Balance Redox
- Comportamiento de la Enzima Dehidroascorbato Reductasa Frente a
- Características Generales de la Enzima DHAR
- Mecanismo de acción de DHAR
- El mango como modelo de estudio
Por lo tanto, se sabe que las plantas han desarrollado mecanismos antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos (Shin et al., 2013). Estas enzimas desintoxican compuestos endógenos o endobióticos (de la propia célula) y xenobióticos (de origen externo) conjugando el tripéptido glutatión (GSH) con una amplia variedad de sustratos (Hayes et al., 2005). De manera similar, en las plantas, las giberelinas y la síntesis de etileno requieren AsA, así como en reacciones catalizadas por dioxigenasas específicas dependientes de AsA (Davey et al., 2000).
Se obtuvieron resultados similares tanto en hojas de papa como en sus órganos y flores (Tedone et al., 2004). Para ello se han realizado varios estudios, y uno de ellos es la sobreexpresión de la enzima DHAR en hojas de tabaco y maíz, lo que resulta en un aumento en el contenido de AsA (Chen et al., 2003). Esto dependerá en gran medida de factores ambientales, genotipo y etapa de desarrollo (Davey et al., 2000) (Figura 3).
Además, los niveles de AsA pueden variar dentro de la misma especie, como el tomate, donde Solanum pennellii contiene más AsA que el cultivar tradicional Solanum lycopersicum (Stevens et al., 2007). Al aumentar el nivel de AsA se asegura una excelente protección de la planta contra el ozono y el H2O2, así como contra otros factores de estrés abiótico (Chen et al., 2005). En cuanto a la fruta, en tomate, se ha demostrado que un aumento de AsA por sobreexpresión de DHAR confiere tolerancia al herbicida metil viológeno y al estrés salino (Li et al., 2012).
Por otro lado, MDHAR redujo los niveles de AsA solo en frutos verdes maduros (Haroldsen et al., 2011). 13 A diferencia de las anteriores, DHAR es una proteína monomérica con un peso molecular de aproximadamente 25 kDa (Dixon et al., 2002). Recientemente se reportó la primera estructura cristalográfica de un DHAR de arroz (OsDHAR) (Do et al., 2016) (Figura 4), un hallazgo que proporciona información para una mejor y más precisa comprensión del comportamiento de la enzima.
Los motivos CxxS y CxxC a menudo se conservan en enzimas redox dependientes de tiol (Jiang et al., 2008). De esta manera, destaca el estudio del DHAR de arroz (Do et al., 2016), donde se propone un mecanismo para la reducción de DHA dependiente de GSH para reciclar AsA.
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
Objetivo General
Objetivos Específicos
MATERIALES Y MÉTODOS
- Análisis de la Secuencia y Estructura de MiDHAR
- Secuencia de MiDHAR…
- Modelación Estructural de MiDHAR
- Expresión Heteróloga de DHAR Recombinante
- Obtención del Constructo de DHAR en un Vector de Expresión
- Transformación de E.coli con el Constructo
- Detección de Clonas Positivas
- Sobrexpresión de DHAR Recombinante
- Purificación de DHAR por Cromatografía Ni-NTA
- Preparación del Clarificado
- Cromatografía de Afinidad a Metales Inmovilizados (IMAC)
- Determinación de la Actividad Enzimática de DHAR
- Caracterización Cinética de DHAR
- Caracterización Bioquímica de DHAR
El marco de lectura abierto de la secuencia de ADNc de MiDHAR (incluido el codón de parada) se optimizó para la lectura de codones en E. coli, y se utilizó para insertar la construcción en el vector de expresión pET19b (Novagen), mediante un gen de bloque G sintético para obtener. (IDT). Para la PCR, se utilizó como plantilla el sobrenadante de una colonia positiva lisada y cebadores específicos para el vector (cebadores universales T7) para verificar la presencia de la construcción dentro de la célula. La secuencia del constructo se confirmó mediante secuenciación (Sequencing Facility, The University of Arizona, Tucson, AZ, EE.UU.) de ADN plasmídico extraído mediante el método de lisis alcalina (Sambrook, 1989) de las 10 células principales transformadas con el constructo.
Se tomaron muestras de cultivo en diferentes momentos después de la inducción (0, 3 y 6 h) para confirmar la sobreexpresión y se obtuvieron precipitados bacterianos. Estos precipitados se resuspendieron en un tampón de lisis (Tris-HCl 50 mM, lisozima 100 µg/ml y PMSF 1 mM) y la lisis celular se realizó mediante sonicación (15 pulsos durante tres ciclos) utilizando un sonicador Branson Sonifer 450 (EE. UU.). En las muestras recolectadas después de la inducción también se determinó la concentración de proteínas mediante el método de Bradford (Bradford, 1976) y la actividad enzimática para DHAR (De Tullio et al., 1998).
Las fracciones de DHAR puras se analizaron mediante SDS-PAGE y tinción con azul de Coomassie, y también se utilizó la tinción con plata como criterio de pureza. La actividad de la enzima DHAR se determinó en un espectrofotómetro Cary 50 UV-Vis (Agilent Technologies, EE. UU.) monitoreando la formación de AsA a una longitud de onda de 265 nm y un coeficiente de extinción molar de ε = 14 mM-1 cm1 (De Tullio et al. al., 1998). La actividad de DHAR se corrigió restando los valores de absorbancia obtenidos en presencia o ausencia de enzima.
Los parámetros cinéticos (Km y Vmax) de DHAR se determinaron midiendo la actividad enzimática como se describe anteriormente, utilizando diferentes concentraciones de DHA (0,1-1,4 mM) y GSH (0,1-5 mM), manteniendo una concentración de sustrato fija y cambiando la concentración. del otro, para los dos sustratos (Yang et al., 2009). Se realizaron tres experimentos diferentes y en cada uno de ellos las mediciones se realizaron por triplicado. De igual forma se realizaron tres experimentos y en cada uno de ellos las mediciones se realizaron por triplicado.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
- Análisis de Secuencia
- Análisis Estructural de DHAR
- Sobreexpresión Heteróloga de DHAR
- Purificación y Caracterización Bioquímica de MiDHAR Recombinante…. 36
Se obtuvo un modelo estructural de la enzima Mango Dhar por homología utilizando el software MOE, utilizando la estructura cristalina de Rice DHAR (OSDHAR) (PDB: 5D9W) como plantilla. Sin embargo, gracias a la obtención de la estructura cristalográfica de OSDHAR se puede obtener información más fina y precisa sobre los residuos que forman parte del sitio activo de Dhars. Efectivamente se verificó que en este análisis no hubo aumento en la sobreexpresión de la banda correspondiente a la proteína de interés (29kDa), lo que concluye que la proteína no es producto del metabolismo natural de la bacteria, sino de la sobreexpresión.
Los DHAR vegetales son miembros de la familia GST que pueden utilizar sustratos como 1-cloro-2,4-dinitrobenceno (CDNB), 4-cloro-7-nitro-2,1,3-benzoxadiazol (NBD-Cl), p - cloruro de nitrobencilo (NBC), ácido 4-nitroftálico (4-NPA) y 3,4-dicloronitrobenceno (DCNB) (Dixon et al., 2002) para conjugación con GSH. Como resultado, estas mutaciones provocaron un aumento en el contenido de hélices α y una disminución en las láminas β, con lo que se observó una marcada termorresistencia de los mutantes en comparación con la forma salvaje de la β-glucosidasa (López-Camacho et al. , 1996). . De manera similar, los aminoácidos cargados pueden participar en la estabilización de las hélices α, lo que resulta en un mejor empaquetamiento de proteínas y, por lo tanto, una mejor termoestabilidad (Sali et al., 1988; Nicholson et al., 1988).
En el caso de MiDHAR, la presencia de grupos cargados en el sitio activo, como Asp19, especialmente Lys8 y Lys210, puede estar relacionada con la estabilización de las hélices α, especialmente aquellas en el dominio tiorredoxina, interactuando a través de sales ácidas y básicas. puentes, que por su naturaleza contribuyen a la termoestabilidad de las proteínas. Todos los miembros de la familia GST muestran una mayor afinidad por el sustrato GSH en comparación con el otro sustrato que conjugan. Aunque los valores de Km son mayores para GSH y menores para DHA como se reporta en trabajos anteriores, los resultados obtenidos de la caracterización cinética de MiDHAR son algo diferentes a lo reportado previamente (Tabla 3).
En este modelo propuesto para el arroz DHAR (OsDHAR) (Do et al., 2016), se propone que la reducción de DHA a AsA por DHAR ocurra en dos pasos, en el primero se realiza la oxidación de la cisteína catalítica (Cys20). generado. ), y en el segundo se produce la reducción (figura 17). Además, se confirma la importancia de este residuo obteniéndose un mutante de la enzima (K8A) y se comprueba que su actividad enzimática disminuye notablemente. En este caso, se puede sugerir de manera similar que la cisteína en la posición 23 puede estabilizar el grupo ionizado de Cys20 debido a la proximidad visualizada entre ellos.
Dado lo anterior, se propone un mecanismo tipo tenis de mesa para la enzima en la región cisteína del sitio activo y una unión secuencial ordenada de GSH en el sitio H (Do et al., 2016). Los aminoácidos responsables de la interacción con AsA y DHA en el DHAR del arroz se conservan en MiDHAR, incluido His160, responsable del reconocimiento de GSH en el sitio G; Sin embargo, aunque Phe se sitúa en la posición 103, está dirigido hacia el sitio activo.
CONCLUSIONES
Increasing ozone tolerance by increasing foliar ascorbic acid provides greater ozone protection than increasing avoidance. Molecular definition of the ascorbate-glutathione cycle in Arabidopsis mitochondria reveals dual targeting of antioxidant defenses in plants. Characterization, cloning and in vitro expression of an extremely thermostable glutamate dehydrogenase from a hyperthermophilic Archaeon, ES4.
Structural understanding of oxidized ascorbate recycling by dehydroascorbate reductase (OsDHAR) from Oryza sativa L. Enhanced tolerance to ozone and drought stresses in transgenic tobacco expressing cytosolic dehydroascorbate reductase. Monodehydroascorbate reductase and dehydroascorbate reductase gene expression during fruit ripening and in response to environmental stresses in acerola (Malpighia glabra).
Dehydroascorbate reductase cDNA from sweet potato (Ipomoea batatas [L.] Lam): expression, enzyme properties and kinetic studies. Enhanced ascorbic acid accumulation through overexpression of dehydroascorbate reductase confers tolerance to methylviolene and salt stresses in tomato. Molecular and biochemical characterization of dehydroascorbate reductase from a stress-adapted C4 plant, pearl millet [Pennisetum glaucum (L.) R.
Coexpression of monodehydroascorbate reductase and dehydroascorbate reductase from Brassica rapa effectively confers tolerance to freezing-induced oxidative stress. Candidate genes and quantitative traits affecting fruit ascorbic acid content in three tomato populations. Ascorbic acid content in tomato fruits is associated with monodehydroascorbate reductase activity and tolerance to chilling stress.