WSSV: virus del síndrome de la mancha blanca (por sus siglas en inglés) XMP: monofosfato de xantina. El virus del síndrome de la mancha blanca del camarón (WSSV) es una de las enfermedades que más pérdidas económicas causa en la acuicultura. En este trabajo, el dominio timidilato quinasa del gen TK-TMK (ORF 454) de WSSV se sobreexpresó y purificó y demostró ser activo de forma independiente.
Thymidylate kinase (TMK) is one of the enzymes involved in the sequential phosphorylation of deoxythymidine triphosphate (dTTP), one of the four nucleotide precursors for DNA synthesis. Shrimp white spot syndrome virus (WSSV) is one of the diseases that causes the most economic losses in aquaculture.
INTRODUCCIÓN
Debido a esto, las nucleótidos quinasas se consideran objetivos adecuados para el tratamiento con fármacos antivirales como los análogos de nucleósidos, que se utilizan para tratar enfermedades virales o proliferativas (Carreras y Santi 1995; Ostermann et al., 2003; De Clercq 2004; Lodish et al. , 2003; De Clercq 2004; Lodish et al., 2004). La rápida proliferación de este virus sugiere que el WSSV tiene un mecanismo de replicación viral altamente eficiente; esta característica de la infección permite el uso de medicamentos antivirales como tratamiento de la enfermedad. Se han obtenido resultados satisfactorios utilizando estos compuestos para el tratamiento de enfermedades tales como cáncer, SIDA, virus del herpes, varicela y otras enfermedades.
ANTECEDENTES
- Importancia Económica de la Infección del WSSV
- Características del WSSV
- Métodos de Control del WSSV
- Síntesis de Precursores de ADN
- Síntesis de Reciclaje
- Síntesis de novo de Purinas
- Síntesis de novo de Pirimidinas
- Síntesis de Timidina Trifosfato
- Timidilato Sintasa
- Timidina y Timidilato Cinasa
- ADN Polimerasa
- Análisis Estructurales de la TMK
- Mecanismo de Reacción de la TMK
- Activación de Análogos Nucleosídicos
La otra diferencia es que la síntesis de pirimidinas no es ramificada, el trifosfato de uridina, uno de los dos ribonucleósidos trifosfato de pirimidina y, por tanto, el producto final de la ruta, es también un sustrato para la formación de trifosfato de citidina, el otro producto final (Lodish et al. al. al., 2004). La cascada de reacciones catalizadas por quinasas que activan los NTP es de importancia médica ya que también son responsables de la activación de análogos de nucleósidos (Lodish et al., 2004). El papel crucial de la DHFR en la biosíntesis de nucleótidos de timidina la convierte en un objetivo ideal para los fármacos quimioterapéuticos (Lodish et al., 2004).
Debido a que TMK participa tanto en el reciclaje como en la síntesis de novo del metabolismo de dTTP, la actividad de TMK es esencial para el metabolismo. Estos cambios conformacionales no se han observado en otras nucleótidos quinasas; parecen ser exclusivos de TMK y pueden ser responsables de la especificidad de estas enzimas (Ostermann et al., 2000).
HIPÓTESIS
OBJETIVO GENERAL
Objetivos Particulares
MATERIALES Y MÉTODOS
- Sobreexpresión y Purificación
- Cromatografía en Capa Fina
- Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia
- Ensayos Enzimáticos
- Calorimetría de Titulación Isotérmica
- Modelado Estructural y Anclaje Molecular
- Cristalización de Proteínas
Para eliminar la etiqueta de histidina, se realizó una digestión con la proteasa PPS mezclando las fracciones de TMKwssv purificadas en el paso anterior y agregando 500 µL de PPS 0,2 mg/mL por cada 20 ml de las fracciones de TMKwssv purificadas por IMAC. TMKwssv sin la etiqueta de histidina se separó de PPS mediante cromatografía usando una columna de glutatión-Sepharose de flujo rápido de 5 ml (GSTrap 5 ml FF, GE) usando 1 paso de elución. Para determinar el peso molecular de la proteína, se aplicó cromatografía de exclusión molecular en una columna Superdex usando Tris HCl 25 mM, pH 7,4 y NaCl 150 mM como tampón de elución, y la cromatografía se realizó isocráticamente.
Se utilizó cromatografía en capa fina (TLC) para determinar la actividad específica de TMKwssv con ATP y dTMP. La determinación de la actividad específica de timidilato quinasa con dTMP y dTDP se realizó mediante cromatografía líquida de alta resolución en un HPLC serie 1100 y un detector UV serie 1100 de Agilent Technologies, (Waldbronn, Alemania), utilizando la técnica descrita por (Ryder 1985) ), optimizado para la separación de dTMP, dTDP y dTTP. 21 enzima, se añadió ácido perclórico hasta una concentración final de 0,6 M, provocando la precipitación de la proteína.
Los parámetros cinéticos de TMKwssv se determinaron mediante un ensayo enzimático acoplado utilizando piruvato quinasa y lactato deshidrogenasa como enzimas secundarias, después de la oxidación de NADH a 340 nm dependiendo de la formación de ADP por la actividad de TMKwssv (Blondin et al., 1994; Topalis et al., 2005; Guevara-Hernández et al., 2012). Las inyecciones fueron de 8 µL y se realizaron hasta observar la saturación de la proteína con el sustrato. Para valoraciones de complejos ternarios, la proteína y la solución de la jeringa se equilibraron con AMP-PNP 1 mM para evitar que la dilución del análogo interfiriera con la reacción.
El modelado de TMKwssv y el acoplamiento molecular con dTMP, dTDP y d4TMP se realizó en el programa MOE versión 2012 (Chemical Computing Group), basado en la identidad de secuencias de aminoácidos deducidas con TMK humana (PDB: 1E9C) ((Ostermann et al., 2000 ). Se utilizó el protocolo de ajuste inducido para un muestreo de 60.000 poses para cada confórmero utilizando el método de posicionamiento del triángulo alfa. La solución proteica de los experimentos realizados en el ITC se utilizó en un complejo ternario con dTMP y AMP-PNP en un final concentración de 10 mg/ml (Tris HCl 25 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, etilenglicol al 10% y MgCl2 5 mM) y una relación 1:1 entre proteína y solución precipitante.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
- Sobreexpresión y Purificación de la TMKwssv
- Formación de dTDP Determinado en Cromatografía en
- Formación de dTTP Determinado en Cromatografía
- Cinéticas de Michaelis-Menten
- Calorimetría de Titulación Isotérmica: Interacción de dTMP
- Constantes de Afinidad de dTMP, dTDP, d4TMP en
- Estudios Estructurales in silico de la TMKwssv
- Cristalización de Proteínas
Cromatograma de la reacción de formación de dTTP catalizada por TMKwssv (línea continua), se observa la formación de dTTP y ADP después de tres horas de reacción. Los parámetros cinéticos de TMKwssv se determinaron utilizando sustratos que participan en la formación de dTTP tanto en la síntesis de novo como en la vía de reciclaje. TMKwssv exhibió actividad catalítica con dTDP, que es el producto natural de la enzima.
Para determinar la interacción de TMKwssv con los sustratos naturales de la enzima dTMP y ATP, se utilizó calorimetría de titulación isotérmica. Para determinar las constantes de afinidad de TMKwssv en un complejo ternario, se utilizó adenilimidodifosfato (AMP-PNP) como análogo no hidrolizable de ATP. Termogramas de unión a TMKwssv en complejo ternario con nucleótidos AMP-PNP y TMK.
Esta diferencia puede consistir en que las condiciones de la etapa de equilibrio en la formación del complejo sustrato no son ideales. Primer plano del sitio activo del complejo ternario de la quinasa viral con ADP, dTMP y d4TMP, obtenido mediante modelado in silico. El modelo estructural obtenido del anclaje molecular de TMKwssv con dTDP se comparó con el modelo estructural teórico de la enzima en complejo con dTMP y no se observaron cambios en la conformación obtenida por la cavidad catalítica.
Respecto a la orientación y posicionamiento de los grupos fosfato de dTDP y dTMP, se observa un reordenamiento en la coordinación de los anillos de pirimidina en la cavidad hidrofóbica del sitio activo de TMKwssv. El posicionamiento de los grupos fosfato de dTDP y dTMP es el mismo en el sitio activo de TMKwssv, esto permite la transferencia del grupo fosfato del nucleótido donante. En la TMK humana, el átomo de magnesio está coordinado con las moléculas de agua que ocupan los espacios entre los fosfatos de ATP y los residuos que forman el sitio activo de la proteína (Ostermann et al., 2000).
CONCLUSIONES
34;Identification of a nucleocapsid protein (VP35) gene from shrimp white spot syndrome virus and characterization of the motif important for targeting VP35 to the nuclei of transfected insect cells." Virology. 34;The Enzymatic Kinetics of carbonic anhydrase from bovine and human erythrocytes." Journal of the American Chemical Society. 34;A synthetic antibacterial peptide from Mytilus galloprovincialis reduces mortality due to white spot syndrome virus in palaemonoid shrimp." Journal of Fish Diseases.
34;Biochemical characterization of white spot syndrome virus thymidine monophosphate kinase: a functional domain from the viral ORF454." 34;Identification of the thymidylate synthase in the white spot syndrome virus genome." Journal of General Virology. 34;Thymidylate kinase from Mycobacterium tuberculosis: a chimera that shares properties common to eukaryotic and bacterial enzymes." Protein Science.
34; Structures of human thymidylate kinase in complex with prodrugs: Implications for structure-based design of new compounds†." Biochemistry. 34; Characterization of Streptococcus pneumoniae thymidylate kinase: forward reaction steady-state kinetics and isothermal titration calorimetry." Biochem. 34; Co-purification of thymidylate kinase and cytosolic thymidine kinase from human term placenta by affinity chromatography.".
34;Identification and characterization of a shrimp white spot syndrome virus (WSSV) gene encoding a novel cell-type thymidine kinase and thymidylate kinase chimeric polypeptide.". : Thymidine kinase activity of recombinant protein expressed in a baculovirus/insect cell system." 34; Functional identity of the active sites of crustacean and viral thymidylate synthases." Comparative Biochemistry and Physiology.
34;Mass mortality of cultured kuruma shrimp Penaeus japonicus in Japan in 1993: electron microscopic evidence of the causative virus." Fish Pathology (Japan). 90 mechanism of human thymidylate kinase obtained from crystal structures of enzyme complexes along the reaction coordinate." Structure.
BIBLIOGRAFÍA
ANEXOS
Biochemical Characterization of Thymidine
Perspectivas Actuales del uso de Proteínas
A novel viral thymidilate kinase with diphosphate
White spot syndrome virus TMK (TMKwssv) has presented a sequentially ordered bi bi reaction mechanism and the efficiency of dTDP production by TMKwssv is one of the highest compared to other organisms. Recombinant overexpression of the entire ORF leads to a protein that had only the enzymatic activity of TK (Tzeng et al., 2002). Details of the recombinant expression and purification have been reported elsewhere (Guevara-Hernandez et al., 2012).
The formation of an intense spot was found to be dependent on the addition of TMKwssv as reported for other nucleotides (Van Rompay et al., 1999). The binding capacity of the nucleoside analog d4TMP in complex with AMP-PNP is offensive use for structural studies of TMK (Osterman, lavie,) Changes in affinity constants were also tested, suggesting that there may be a change in the arrangement of the binding pocket of tmk between d4TMP and the substrate (Figure 7). 77 constants determined for natural substrates of the enzyme indicated a high efficiency of dTDP formation.
The conformation of the catalytic cavity formed by the P loop, the cap loop and the loop with the catalytic residues is shown. 34;Improved spectrophotometric assay of nucleoside monophosphate kinase activity using the pyruvate kinase/lactate dehydrogenase coupling system.". PloS one 9(4): e94369.
34;Characterization of a race-related nuclear protein (Ran protein) that is upregulated in the antiviral immunity of shrimp." Immunology of fish and crustaceans. 34;Analysis of the first complete DNA sequence of an invertebrate iridovirus: coding strategy of the genome of Chilo iridescent virus.” Virology. 34; Differential gene expression profile in the hepatopancreas of WSSV-resistant shrimp (Penaeus japonicus) by suppressing subtractive hybridization.”
34; Performance of WSSV-infected and WSSV-negative Penaeus monodon postlarvae in culture ponds." Diseases of Aquatic Organisms. 34; Determination of Adenosine Triphosphate and Its Breakdown Products in Fish Muscle by High-Performance Liquid Chromatography up." Journal of Agricultural and Food Chemistry.