Estos compuestos son una clase de triterpenos altamente oxigenados que se encuentran principalmente en las semillas de los cítricos. Con el desarrollo de este trabajo se podrá contribuir al aprovechamiento de subproductos mediante el uso del proceso de extracción con CO2 supercrítico, debido a que es una técnica que se ha utilizado en los últimos años para la obtención y purificación de productos naturales.
LOS CÍTRICOS
Estructura macroscópica y microscópica
Una capa de mucílago y pectina en el exterior de la semilla evita que se seque y la suaviza. El final del ángulo agudo es el punto de la semilla donde se inserta el embrión del fruto.
Efecto de factores climáticos en la composición química de las frutas
Además, en estas semillas, la mayor concentración de limonoides se encuentra en forma de aglicona; Se trata de compuestos de naturaleza triterpenoide y tienen una amplia gama de actividades beneficiosas para los seres humanos.
Procesamiento
Stange et al., 2002) podría incluso ser una fuente importante de limonoides, lo que podría proporcionar una alternativa contra la neoplasia (Manners et al., 2007; Breksa et al.
LIMONOIDES
Biosíntesis de limonoides
Las rutas de biosíntesis de limonoides se propusieron basándose en un estudio de trazadores radiactivos desarrollado por Hasegawa et al. La actividad de la glucósido limonoide β-glicosidasa, que cataliza la hidrólisis de limonoides glicosilados para liberar la aglicona limonoide y la glucosa durante la germinación de las semillas, ocurre sólo en las semillas (Hasegawa et al., 2000).
Estabilidad de los limonoides
Además, la estabilidad de la limonina se ve afectada por la temperatura en condiciones ácidas o básicas.
Actividad biológica de los limonoides
EL CANCER
El cancer y bioactivos de origen natural
Hazrat Bilal, Waseem Akram, and Soaib Ali-Hassan, (2012) "Larvicidal Activity of Citrus Limonoids against Aedes albopictus Larvae", J Arthropod Borne Dis. Bhimanagouda, (2010) "Characterization of Citrus aurantifolia bioactive compounds and their inhibition of human pancreatic cancer cells by apoptosis", J.
INTRODUCCIÓN
Este capítulo también presentará los conceptos básicos de la identificación de limonoides obtenidos y cómo la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) ha sido una herramienta muy útil para identificar compuestos bioactivos en plantas.
EXTRACCIÓN
Elección del solvente
Diferentes solventes producirán diferentes extractos y diferentes composiciones de extractos (Luque de Castro et al., 2010; Zarnowski y Suzuki, 2004). El alto punto de ebullición para la recuperación de solventes se puede reducir aplicando vacío o usando una membrana de separación para la recuperación de solventes (Luque de Castro et al., 2010; Wang et al., 2006).
EXTRACCIÓN CON FLUIDOS SUPERCRÍTICOS
- Historia
- Propiedades de los fluidos supercríticos
- Dióxido de carbono como solvente supercrítico
- Proceso de extracción supercrítica
Las principales desventajas de la extracción Soxhlet incluyen: (1) el tiempo de extracción es largo; (2) se utiliza una gran cantidad de disolvente; (3) no se puede proporcionar agitación en el aparato soxhlet para acelerar el proceso; (4) la gran cantidad de disolvente utilizado que requiere concentración mediante evaporación y (5) la posible descomposición térmica de compuestos termolábiles. El principio básico de la extracción FSC es que la solubilidad de un compuesto determinado (soluto) en un disolvente varía tanto con la presión como con la temperatura. Algunas de las ventajas y desventajas de la extracción con solventes supercríticos en comparación con los métodos convencionales se resumen en la Tabla 2.2.
EXTRACCIÓN DE LIMONOIDES
El uso de dióxido de carbono en estado supercrítico ha demostrado ser un método eficaz para la obtención de moléculas bioactivas a partir de fuentes vegetales, por ejemplo la extracción de β-sitosterol, vitamina E y escualeno de semillas de yuzu (Citrus junos) (Ueno et al., 2008), varios flavonoides como la naringina se extrajeron de la cáscara de pomelo (Citrus paradisi) en menos tiempo y uso de solventes que las técnicas convencionales (Giannuzzo et al., 2003). En estudios recientes se han aislado con éxito isoflavonas, carotenoides y ácidos grasos a partir de diversas matrices naturales (Herrero et al., 2010). La extracción con CO2 supercrítico es un método particularmente eficaz para aislar triterpenos, incluida la limonina (Tabla 2.3), en un tiempo de proceso corto (2 horas en promedio) y un rendimiento comparable al obtenido con el método clásico.
CROMATOGRAFÍA
Herman et al., 1990 utilizaron HPLC de fase reversa C18 para cuantificar limonoides glicosilados; Los limonoides de aglicona se separaron en una columna de fase reversa C18 eluida con metanol-acetonitrilo-agua, mientras que los limonoides glicosilados se separaron en una columna de fase reversa C18 con ácido fosfórico 3 mM y acetonitrilo (Vikram et al., 2007). Recientemente, se describió otro método de HPLC en fase normal para la separación de agliconas limonoides en una fase neutra (Vikram et al., 2007). Tian y Ding (2000) desarrollaron un método de detección para detectar limonoides glicosilados, utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento en una columna de fase inversa C18 con un detector de matriz de diodos y espectroscopía de masas.
CITOTOXICIDAD
Ensayo de reducción del MTT
El producto de la reacción, el formazán, se retiene en las células y puede liberarse mediante su digestión. La capacidad de las células para reducir el MTT constituye un indicador de la integridad mitocondrial y su actividad funcional se interpreta como una medida de la viabilidad celular. Determinar la capacidad de las células para reducir MTT a formazán tras la exposición a un compuesto permite obtener información sobre la toxicidad del compuesto que se está evaluando (Jiménez et al. 2007).
CONCLUSIONES
A Supercritical Carbon Dioxide Extraction Study for Ganoderma Lucidum†. Research in Industrial and Engineering Chemistry, Vol. 2003) "Alternatives to Animal Testing: Research, Trends, Validation and Regulatory Acceptance". Characterization of bioactive compounds of Citrus aurantifolia and their inhibition of human pancreatic cancer cells by apoptosis. Bhimanagouda, (2011) “Citrus limonin and its glucoside inhibit colon adenocarcinoma cell proliferation through apoptosis”, J. Supercritical Fluid Processing Supercritical Fluid Extraction and Chromatography, Vol.
INTRODUCCIÓN
Actualmente y mediante técnicas de rayos X, resonancia magnética nuclear, HPLC, entre otras, se han identificado más de 39 limonoides en estado aglicona y 17 limonoides glicosilados en diferentes especies de cítricos (Manners et al., 2004; Jayaprakasha et al., 2008 ; Bhimanagouda et al., 2009; Bresca et al., 2008). Para la extracción de limonoides existe ambigüedad sobre los tiempos y solventes a utilizar en la extracción, ya que según Vikram et al., 2007 se recomienda el acetato de etilo con un tiempo de extracción Soxhlet de 4 horas, aunque en el 2010, Lo mismo Vikram et al. Algunos limonoides incluso han mostrado actividad antitumoral en tumores en la boca de hámsters (Miller et al., 2000).
MATERIALES Y MÉTODOS
- Materia Prima
- Caracterización de Semillas
- Extracción con solventes
- Evaluación de citotoxicicidad
La extracción de limonoides comienza con la eliminación del aceite vegetal mediante lixiviación con hexano en un arreglo tipo soxhlet. Una vez retirado el petróleo, se realiza una segunda lixiviación utilizando diferentes disolventes. La evaluación de la citotoxicidad de los extractos se realizó en cultivos de células de linfoma L5178Y, comenzando con la extracción de las células L5178Y mediante punción del peritoneo de ratón, extrayendo 1 ml de las mismas, Figura 3.4, y colocándolas inmediatamente en un tubo de vidrio. metido. 13 x 100. La evaluación de la citotoxicidad de los extractos se realizó en cultivos de células de linfoma L5178Y colocados en cajas de 96 pocillos (costo 3595) a los que se les aplicaron diferentes concentraciones (120 μg/ml, 80 μg/ml, 60 μg/ml ml). ml), ml, 40μg/ml) de los extractos de semillas de C.
RESULTADOS
Extracción con solventes
Además, la interacción entre el tipo de solvente y la semilla de cítricos fue significativa en cuanto al rendimiento de extracto limonoide de C. DOCTORADO EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA 61 Figura 3-5 Rendimiento de extracto limonoide dependiendo del tipo de solvente utilizado para cada limón. El efecto particular del tipo de semilla de cítricos sobre el rendimiento de extracto limonoide de cada fruto se puede observar en la Figura 3.7 donde se observan dos grupos homogéneos, uno formado por C.
Citotoxicidad de extractos de semillas de cítricos
En el análisis de la citotoxicidad que presentan los extractos de semillas, en la Figura 3.8 se encuentra que la mayor citotoxicidad la representan los extractos limonoides obtenidos de las semillas de C. Finalmente, el efecto de la concentración de extractos limonoides sobre la citotoxicidad se puede observar en Figura 3.15, donde se muestra la relación dosis-respuesta para los cítricos C. Dosis citotóxica media para el extracto de limonoide obtenido de la semilla de C.
CONCLUSIONES
Characterization of bioactive compounds from Citrus aurantifolia and their inhibition of human pancreatic cancer cells by apoptosis”, J. Bhimanagouda, (2011), “Structure-function relationships of citrus limonoids on p38 MAP kinase activity in human aortic smooth muscle cells”, European J. Manieren Gary D., Breksa III Andrew P., Schoch Thomas K., Hidalgo Marlene B. 2003) "Analysis of Bitter Limonoids in Citrus Juices by Atmospheric Pressure Chemical Ionization and Electrospray Ionization Liquid Chromatography-Mass Spectrometry" J. of Agriculture and Food Chemistry, vol . 2007).
INTRODUCCIÓN
CITOTOXICIDAD DE LIMONOIDES DEL EXTRACTO DE C. AURANTIFOLIA UTILIZANDO FLUIDOS SUPERCRÍTICOS.. col., 2014; Khan et al., 2014); Proporciona una cantidad de semillas de aproximadamente el 4% del peso total procesado, que es similar en cantidad de semillas al C. La extracción de limonoides se suele realizar mediante disolventes orgánicos mediante la técnica de Soxhlet (Chen et al., 2007; Balestrieri et al., 2011; Jinhee et al., 2012) así como algunas variaciones de los mismos, como soxhlet asistido con ultrasonido o simplemente por maceración, maceración con agitación, entre otros. En particular, para los limonoides, se reportó la extracción de semillas de pomelo utilizando CO2 en estado supercrítico, obteniendo un rendimiento de limonina de 6,3 mg/g de semilla seca, contenido similar al obtenido por extracción con solventes orgánicos, pero el tiempo de extracción se redujo en 14 horas; Esta reducción se debe a que para la extracción con CO2 no es necesaria la eliminación del aceite vegetal y la evaporación del disolvente, quedando el tiempo de extracción para fluidos supercríticos en 2 horas (Yu et al., 2007).
MATERIALES Y MÉTODOS
- Extracción con solventes
- Extracción mediante fluidos supercríticos
- Análisis HPLC (High-performance liquid chromatography)
- Extracción con Fluidos supercríticos
- Actividad Citotóxica contra L5178Y
Se utilizó un estándar de limonina (Sigma-Aldrich) para la identificación y se realizó una curva de calibración con el mismo estándar para la cuantificación (Apéndice ##) de limonina en los extractos. DOCTORES EN CIENCIA Y TECNOLOGÍA 92 Figura 4-14 Efecto de la presión y la temperatura sobre el contenido de limonina. Este contenido de limonina también fue mucho menor que el informado por Jaiprakash et al., 2010; y Jaiprakash et al., 2009, cuando utilizaron acetato de etilo obtuvieron 3.9 mg de limonina/g de semilla, y con metanol obtuvieron 1.6 mg de limonina/g de semilla, y con acetona obtuvieron 0.48 mg de limonina/g de semilla obtenida.
CONCLUSIONES
Silva, (2014), “Supercritical fluid extraction from coffee grounds: measurement of extraction curves, oil characterization and economic analysis”, Journal of Supercritical Fluids, Vol. 2015), “Evaluation of limonoid production in suspension cell culture of Citrus sinensis”. Mishima, (2003), “Supercritical fluid extraction of naringin from the peel of Citrus paradisi”, Phytochemical Analysis, Vol. Bhimanagouda, (2007) “Purification of citrus limonoids and their differential inhibitory effects on human cytochrome P450 enzymes”, J.of the Science of Food and Agriculture, Vol.
CONCLUSIONES
Extracción mediante solventes
Durante la extracción con solvente se encontró que los limonoides contenidos en los extractos son sensibles al tipo de solvente utilizado para su extracción y también dependen del tipo de semilla de cítrico utilizada. Uno de los aportes que se logró con la realización de esta tesis fue la optimización del proceso en base a la actividad citotóxica, teniendo alternativas que contribuyan al aprovechamiento de subproductos del procesamiento de cítricos, es decir, se cuenta con conocimientos y parámetros de operación relevantes. . procesar las semillas de cualquiera de estos tres cítricos (C. sinensis, C. reticulata y C. aurantifolia swingle) con el fin de maximizar su rendimiento y su actividad biológica.
Extracción mediante fluidos supercríticos
Finalmente, podemos decir que con el trabajo realizado en esta investigación y gracias al conocimiento de la solvatación de limonoides en los diversos procesos de extracción desarrollados, se pudo desarrollar un uso alternativo para las semillas que actualmente se encuentran desechadas. Así, los extractos de limonoides pueden considerarse ingredientes alimentarios y contribuir al desarrollo de diversos productos principalmente en beneficio de la industria alimentaria y farmacéutica.
PERPECTIVAS
CURVA DE CALIBRACIÓN
Como se muestra en la Figura A.1, la segunda dilución (0,25 mg lim/ml) está significativamente fuera de la línea de tendencia y, además, el estándar antes de ser introducido en el HPLC mostró claras diferencias en volumen en comparación con las otras diluciones.
CRONOMATOGRAMAS: ESTÁNDARES Y MUESTRAS