Luis Brieba por su aceptación y apoyo, tanto técnico como académico, durante la estancia de investigación en el Laboratorio de Bioquímica Estructural de Javier Hernández Paredes del Departamento de Física de UNISON, por su invaluable aporte al conocimiento y sugerencias críticas en el desarrollo de experimentos para la caracterización de compuestos quirales.
INTRODUCCIÓN
Estas proteínas redox le dan a la bacteria la capacidad de defenderse y continuar su crecimiento y desarrollo, así como modular la presencia de ROS dentro de la célula (Zaffagnini et al., 2008; Meyer et al., 2009; Ezraty et al., 2017 ). 18 se basa en las técnicas y métodos de laboratorio antes mencionados, es la caracterización y diseño de medicamentos y sustancias antimicrobianas de nueva generación, basados en la estructura de moléculas objetivo, bacterias y organismos patógenos en alimentos para consumo humano (Santos et al., 2017).
ANTECEDENTES
Glutamato racemasa – VpGluR
La estructura cristalográfica de EcGluR mostró que tiene una estructura terciaria monomérica (Doublet et al., 1994); Sin embargo, aunque se necesita el cofactor PLP para llevar a cabo la catálisis, también se necesita un activador. Por otro lado, se encontró que EcGluR tiene otra función alternativa como proteína moonlightint (Moore, 2004; Jeffery, 2016), ya que participa en la regulación de la síntesis de ADN por vía endógena, como mecanismo de regulación negativa, de la ADN girasa (Ashiuchi et al. al., 2002; Collin et al., 2011; Sengupta et al., 2008).
D-glutamato:cloro – D-Glu:Cl
Además de presentar otras aplicaciones aplicadas en el laboratorio como la formación de sintetizadores in vitro en ingeniería de cristales (Tilborg et al., 2014); así como en la obtención de nuevos materiales con propiedades ópticas no lineales (NLO) (Jiang & Fang, 1999). Este parámetro es capaz de distinguir entre formas del enantiómero L o D (Flack, 1983), el cual es fundamental en el diseño de fármacos y medicamentos para uso humano, ya que una mala designación de la configuración absoluta puede tener graves consecuencias para la salud humana y animales. (Barrow et al., 1969; Papaseit et al., 2013; Zlotos et al., 2019; Kee et al., 2019).
Glutarredoxina 2 – VpGrx2
Estas proteínas redox también participan en procesos esenciales como la regulación de la diferenciación celular, la transcripción y la apoptosis; Además, pueden actuar como acompañantes para facilitar el plegamiento de proteínas (Berndt et al., 2008). Los Grxs realizan estas funciones a través de la S-glutationilación reversible de proteínas, utilizando el poder reductor de las cisteínas (Cys) en el sitio activo, donde la Cys en el extremo N-terminal es esencial para la función de glutatión (Dalle-Donne et al. al. . ., 2009).
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
Objetivo General
Objetivos Específicos
MATERIALES Y MÉTODOS
VpGluR
- Sobreexpresión Heteróloga de VpGluR
- Solubilización y Replegamiento de VpGluR
- Purificación de VpGluR por Cromatografía de Afinidad (IMAC)
- Determinación de la Estructura Cuaternaria de VpGluR
- Actividad Enzimática de VpGluR
- Experimentos de Difracción, Rayos-X y Colecta de Datos
- Modelo Estructural 3D in silico de VpGluR
Luego se dializó la proteína frente a un volumen de 150 ml de solución de unión (A) durante 2 horas y se realizó un intercambio del mismo volumen y duración. A continuación, la proteína se dializó durante 10 horas a un volumen 20 veces mayor que el de la muestra de solución de unión (A) para eliminar los compuestos (glutatión, glucosa, EDTA) que afectan la cromatografía IMAC.
D-Glu:Cl
- Síntesis y Cristalización de D-Glu:Cl
- Difracción de Rayos-X de Monocristal de D-Glu:Cl
- Configuración absoluta de D-Glu:Cl y validación del modelo
Finalmente, los datos cristalográficos de la estructura cristalina del ácido D-glutámico:cloruro (D-Glu:Cl) han sido depositados en el Cambridge Crystallographic Data Center (CCDC) con número de identificación: CCDC-1515166. Con los datos cristalográficos de la estructura de D-Glu :Cl dilucidado se procedió a analizar, asignar y validar su configuración absoluta. A continuación, antes de determinar la configuración absoluta (R o S), se analizaron los parámetros de buena calidad (R') R1 y wR2 (Hooft et al., 2008), para proceder a la determinación de la configuración absoluta del compuesto de interés. . .
Finalmente, para la determinación y asignación de la configuración absoluta de D-Glu:Cl, se analizaron los diferentes modelos estadísticos: Flack (X), Parsons (Z), Hooft (y) y Hooft (G) (Flack, 1983; Spek , 2003; Hooft et al., 2008; Murakami et al., 2010; Parsons et al., 2013), para cada uno de los cuales se obtuvieron sus valores estándar estimados e incertidumbres (esd o su). La verificación de la validez de los datos se realizó mediante análisis estadístico t-Student para determinar si la asignación de la configuración absoluta (R o S) de D-Glu:Cl era correcta. Los pares de Artemisa obtenidos mediante el refinamiento de la estructura también fueron analizados para saber si era posible asignar los datos obtenidos (intensidades) a una de las configuraciones absolutas de la estructura, ya sea en D-Glu:Cl (R) o D - Glu:Cl(S).
Finalmente, se realizó una prueba estadística bayesiana, donde se analizaron diferentes hipótesis para la asignación de la configuración absoluta, de dos maneras (P2 - correcta, P2 - incorrecta) o de tres maneras (P3 - correcta, P3 - gemelo racémico, P3 - incorrecto) (Hooft et al., 2008).
VpGrx2
- Preparación del ADN plasmídico (ADNp) de VpGrx2
- Ligación del gBlock de VpGrx2 en el vector de clonación pJET1.2/blunt
- Obtención del ADNp (pJET1.2/blunt-gBlock) de VpGrx2
- Digestión del ADNp (pJET1.2/blunt-gBlock) y el vector de
- Ligación del gBlock de VpGrx2 en el vector de expresión pET11a
- Obtención del ADNp (pET11a-gBlock) de VpGrx2
- Sobreexpresión Heteróloga de VpGrx2 en E. coli
- Purificación de VpGrx2
- Cromatografía de afinidad (IMAC)
- Cromatografía por filtración en gel o exclusión molecular (SEC)
- Actividad Enzimática de VpGrx2
- Actividad tipo GRX
- Actividad tipo GST (híbrida)
- Modelo Computacional 3D de VpGrx2
Se descongeló una botella con 50 µl de bacterias TOP 10 en un recipiente con hielo (5 – 7 min) (Howland, 1996) y se agregaron 5 µl de ADN plasmídico linealizado (pJET1.2/stump-gBlok) de la solución de ligadura. . Al día siguiente se iniciaron experimentos de sobreexpresión de la proteína de interés. Una vez obtenida la proteína en solución a partir de la lisis bacteriana, se purificó mediante cromatografía de afinidad iónica (IMAC) en un primer paso y mediante cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) en un segundo paso.
De manera similar, se equilibró una columna HiTrap Hp de 1 ml (GE, EE. UU.) con 5 volúmenes de columna de solución de unión (A) antes de realizar la purificación; Luego se realizó una cromatografía en gradiente donde se inyectó un volumen de 10 ml de solución de VpGrx2 a un caudal de 0,5 ml/min y se continuó a un caudal de 1,0 ml/min durante la elución. Al día siguiente, se aclimató el sistema de cromatografía Äkta Pure ® con 15 mL de la misma solución en la que se realizó la cromatografía. Se combinaron fracciones puras de VpGrx2 procedentes de la filtración en gel y se midió la concentración de proteínas mediante el método del ácido bicinconínico (BCA).
El modelo predictivo 3D in silico de VpGrx2 se obtuvo utilizando el servidor Phyre2 y herramientas bioinformáticas (Kelley & Sternberg, 2009; Kelley et al., 2015) mediante la secuencia de aminoácidos de la proteína con la que se generó el modelo 3D como base para usar.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Glutamato racemasa – VpGluR
- Sobreexpresión heteróloga de VpGluR
- Replegamiento in vitro de VpGluR
- Purificación de VpGluR por cromatografía de afinidad y exclusión molecular
- Purificación de VpGluR por IMAC
- Purificación de VpGluR por filtración en gel y determinación de su
- Cristalización de VpGluR
- Modelo estructural 3D in silico de VpGluR
- Actividad enzimática de VpGluR
La Figura 3 (carriles 1 a 5) muestra el proceso de extracción de los cuerpos de inclusión VpGluR de la lisis bacteriana (carril 1) y su posterior solubilización utilizando una alta concentración de urea (8 M). Para dilucidar la estructura teórica de VpGluR se realizó un modelo in silico utilizando el servidor Phyre2, con el cual se obtuvo un modelo tridimensional (3D) de VpGluR. Los residuos catalíticos responsables de la racemización del glutamato (amarillo) se muestran en color para la estabilización del sustrato durante la desprotonación (azul) y la protonación (rojo); así como los relacionados con la estabilización del sitio activo (naranja y morado).
El tercer paso consiste en modelar, a partir del esqueleto previamente obtenido, las regiones de unión o 'bucles' de la estructura secundaria (alfa-hélices y beta-láminas) de la proteína. Lo anterior se puede verificar en la Figura 8, donde se muestra el alineamiento de la secuencia de aminoácidos de VpGluR con otras racemasas. La Figura 9 muestra la actividad enzimática tanto de VpGluR como de la enzima acoplada L-GDH.
55 La Figura 9-B muestra el valor de las pendientes de la reacción sin enzima (VpGluR blanco) de 0,002 y el experimento con enzima (enzima VpGluR) de 0,003.
D-Glutamato:cloro – D-Glu:Cl
- Estructura cristalográfica de D-Glu:Cl
- Orientación y configuración absoluta teórica de la estructura cristalográfica
- Asignación experimental de la configuración absoluta de D-Glu:Cl en base a su
De esta forma, se asignó la configuración absoluta a D-Glu:Cl como molécula R o recta, siendo su nombre propio D-Glu:Cl(R). Antes de analizar la configuración absoluta de D-Glu:Cl, la estructura refinada se realizó utilizando el método de mínimos cuadrados como se muestra en la Tabla 1. La Tabla 1 también muestra el análisis (refinamiento) de la estructura como si este isómero fuera D-Glu: Cl(S), ya que sirvió como control negativo para la asignación de configuración absoluta.
La comparación del parámetro de configuración absoluta de Hooft (G) basándose únicamente en los datos observados (intensidades) confirma los resultados obtenidos en los otros parámetros tanto para D-Glu:Cl(R) como para D-Glu:Cl(S)). Este resultado es consistente con lo obtenido en los parámetros de configuración absoluta descritos anteriormente, que en conjunto indican que la configuración absoluta correcta es (R). 64 siempre que la estructura tenga una configuración absoluta como "S" (Figura 12 imagen inferior), arrojaron valores que demuestran que la estructura correcta es D-Glu:Cl "R".
Los resultados anteriores muestran entonces que la asignación de la configuración absoluta de D-Glu:Cl como “S” es incorrecta, confirmando que se asigna la configuración absoluta de D-Glu:Cl(R), como se encuentra en los parámetros experimentales de la Tabla 2 .
Glutarredoxina 2 – VpGrx2
- Expresión heteróloga de VpGrx2
- Purificación de VpGrx2 por cromatografía de afinidad y exclusión molecular
- Purificación de VpGrx2 por IMAC
- Purificación de VpGrx2 por filtración en gel y determinación de su
- Modelo 3D in silico de VpGrx2
- Actividad enzimática de VpGrx2
- Actividad tipo GRX de VpGrx2
- Actividad tipo GST (híbrida) de VpGrx2
En esta cromatografía, se purificó completamente la proteína de tamaño esperado de VpGrx2 (27 kDa) y se determinó su estado oligomérico. Curva estándar de VpGrx2 (C): valor representativo (punto rojo) de la estructura terciaria de VpGrx2 (27 kDa = monómero). Resaltada en azul claro (aguamarina) hay una molécula de glutatión, que encaja en el espacio tridimensional de la cavidad (sitio activo) de VpGrx2.
La alineación de VpGrx2 con otras glutaredoxinas (Figura 18) muestra que la cisteína N-terminal está estrictamente conservada, independientemente de si la proteína tiene una (monotiol) o dos (ditiol) cisteínas en el sitio activo, esto es esencial para el transporte. función redox (Herrero & Torre-Ruiz, 2007; Lillig et al., 2008; Li & Outten, 2012). La Tabla 3 muestra la actividad específica de tipo redox de VpGrx2 en comparación con otros Grx. Lo primero que llama la atención es que el valor de actividad de tipo redox de VpGrx2 es muy bajo en comparación con otros Grx.
La actividad similar a GST de VpGrx2 como se muestra en la Tabla 4 contrasta con los resultados de actividad similar a GRX en la Tabla 3, ya que la actividad enzimática como transferasa se parece más a las actividades de otras GST.
CONCLUSIONES
RECOMENDACIONES
Para posteriormente desafiar las cepas eliminadas contra diversos factores de estrés como el choque térmico, el choque oxidativo o los xenobióticos (CDNB) (Kalinina et al., 2014).
Korte protocollen in de eiwitwetenschap: een compendium van methoden uit de huidige protocollen in de eiwitwetenschap John Wiley & Sons Inc. Espaillat, A., Carrasco-López, C., Bernardo-García, N., Pietrosemoli, N., Otero, L. Y., Hernández-Paredes, J., Soberanes, Y., Valenzuela-Chavira, I., Garcia-Orozco, K.A., Puentes-Camacho, D., Calderón-De-La-Barca, A. Gomez-Jimenez, S., Noriega -Orozco, L., Sotelo-Mundo, R. Springer Tracts in Advanced Robotics, Vol.
APÉNDICES
Apéndice A – VpGluR: Preparación de soluciones y medios
Preparar 750 ml de una solución sin reductor, que se agrega fresca en el momento de su uso. Preparar 400 ml de una solución sin reductor, que se agrega fresca en el momento de su uso. La solución tampón para VpGluR se utiliza durante la diálisis de la proteína antes de su purificación por IMAC, así como para mantenerla para experimentos posteriores.
Apéndice B – VpGrx2: Preparación de soluciones y medios