Evaluación de la patogenicidad de aislados de Fusarium oxysporum en plantas de Nardo (Polianthes tuberosa). Evaluación de la protección contra la infección por Fusarium oxysporum de plantas de nardo (Polianthes tuberosa) de aislados de Trichoderma sp.
NARDO (Polianthes tuberosa)
Importancia y Usos
Este hongo es capaz de secretar enzimas y pequeñas proteínas durante la colonización de los vasos del xilema de la planta (Houterman, et al. 2007). Este hongo es capaz de secretar enzimas y pequeñas proteínas durante la colonización de los vasos del xilema de la planta de tomate (Houterman PM et al. 2007).
Trichoderma spp. y sus mecanismos de protección
Las especies de Trichoderma suelen aislarse de la rizosfera de los cultivos, ya que estos hongos se asocian fácilmente con las plantas. En otros trabajos realizados por Salazar et al. 2011) en plantas de tomate (Solanum lycopersicum L.) se utilizó una metodología similar, aplicando suspensión de esporas de Trichoderma harzianum en la base de la planta cuando aún se encuentra en el semillero y también se aplicó al realizar el trasplante, el cual. implicó tiempo, espacio y el uso de muchos materiales vegetales.
Interacción planta-patógeno-antagonista
Por otro lado, se necesitan estudios de la interacción planta-patógeno-antagonista para comprender los procesos inducidos entre los participantes. La presencia de los principales mecanismos de patogénesis de Fusarium oxysporum evaluados con pruebas in vitro está directamente relacionada con el desarrollo y severidad de la pudrición de raíces y bulbos en nardus.
OBJETIVOS
OBJETIVO GENERAL
La presencia del mayor número de mecanismos protectores evaluados en pruebas in vitro en cepas de Trichoderma está directamente relacionada con una mayor protección contra la infección por Fusarium sp.
OBJETIVOS ESPECIFICOS
AISLAMIENTO DE HONGOS ASOCIADOS A RAÍZ Y BOMBILLO DE NARDUS EN ESPECIES SILVESTRES DEL GÉNERO Polianthes.
- Aislamientos de Fusarium spp. asociados a la pudrición de raíz y bulbo del Nardo
- Identificación de Fusarium oxysporum
- Aislamientos e Identificación de Phytophthora spp
- Aislamientos e identificación de Trichoderma spp
Se recolectó suelo y material vegetal de diferentes características para aislar Phytophthora sp. Se recolectó suelo de diferentes sitios de recolección (Tabla 6.1) de la rizosfera de especies silvestres del género Polianthes y material vegetal de cultivos comerciales que ya se ha mencionado que contienen Trichoderma sp.
Extracción de compuestos antifúngicos de Polianthes tuberosa
- Extracción de fitoanticipinas (saponinas) provenientes del bulbo y raíz del Nardo (Polianthes tuberosa). Nardo (Polianthes tuberosa)
- Cuantificación de saponinas por espectrofotometría
- Evaluación de la colonización y penetración de raíces de Nardo (Polianthes tuberosa) por Fusarium oxysporum
- Evaluación de enzimas degradadoras de la pared celular vegetal (Pectinasas)
- Resistencia al estrés oxidativo por producción de especies reactivas de oxigeno de F. oxysporum frente a Paraquat
- Resistencia de los aislamientos de Fusarium oxysporum frente a fitoanticipinas (Saponinas) producidas por el Nardo (Polianthes tuberosa)
- Evaluación de resistencia a fitoanticipinas en placa
- Evaluación de patogenicidad de los aislamientos de Fusarium oxysporum in planta
- Tinción y observación de raíces de los tratamientos en pruebas de patogenicidad. patogenicidad
- Evaluación de la producción de fitotoxinas por los aislamientos de Fusarium oxysporum
Para esta prueba también se utilizaron tubos Eppendorf de 1,5 ml, donde la reacción se realizó con sólo 25 µl de cada una de las diferentes concentraciones de las muestras de saponina disueltas en agua, 475 µl de acetato de etilo, 250 µl de muestra A y 250 µl de muestra B., todo por triplicado. Evaluación de la colonización y penetración de raíces de nardo (Polianthes tuberosa) por Fusarium oxysporum. tuberosa) de Fusarium oxysporum.
EVALUACIÓN DE LOS MECANISMOS DE PROTECCIÓN DE AISLAMIENTOS DE Trichoderma sp
- Evaluación de los mecanismos de protección de aislamientos de Trichoderma sp
- Prueba de colonización de raíces de Nardo (Polianthes tuberosa) por aislamientos de Trichoderma spp. aislamientos de Trichoderma spp
- Prueba de antagonismo directo in vitro (cultivos duales)
- Extracción de enzimas quitinasas y glucanasas de Trichoderma spp
- Evaluación del efecto antifúngico de las enzimas producidas por los aislamientos de Trichoderma sp
- Evaluación de la protección contra la infección de Fusarium oxysporum de los aislamientos de Trichoderma in planta
- Colonización de las raíces de nardo por parte de Trichoderma y Fusarium oxysporum durante su interacción con la raíz del nardo
Se colocaron de 3 a 4 raíces por caja, las raíces se colocaron en un extremo de la caja petri, luego se colocó la suspensión de esporas de los diferentes aislados de Trichoderma sp. La inoculación se realizó colocando una gota de suspensión de esporas a una concentración de 1X106 por cada fragmento de raíz en el otro extremo de la caja. 29 aislamientos de Trichoderma sp. utilizados, los cuales fueron seleccionados en las pruebas de colonización de raíces.
Evaluación de la protección contra la infección por Fusarium oxysporum por Trichoderma en aislados de planta.
Aislamientos de Fusarium spp
En primer lugar, se evaluó la capacidad de colonización y penetración de la raíz de Nardo. Evaluación de la colonización y penetración de raíces de nardo (Polianthes tuberosa) por aislados de Fusarium oxysporum. tuberosa) de aislados de Fusarium oxysporum. Evaluación de la colonización y penetración de raíces de nardo (Polianthes tuberosa) por aislados de Fusarium oxysporum.
Evaluación de la producción de enzimas que degradan la pared celular vegetal (Pectinasas) por Fusarium oxysporum.
En la parte superior de la figura se observa el crecimiento de la cepa F-18 (POF-8) respecto a otras cepas, siendo F-18 la cepa que muestra mayor crecimiento en el medio PEL. En la parte inferior de la figura se observa el crecimiento de la cepa F-2 (POF-1) y F-13 (POF-6) en comparación con otras cepas de Fusarium oxysporum, siendo F-2 la cepa que tiene un mayor crecimiento en el medio PEL, aunque menor que el crecimiento mostrado por la cepa F-18 con 1.04mm y F.2 con 1.03mm y F-13 con 1.02mm de radio. Evaluación de la producción de enzimas degradantes de la pared celular vegetal (Pectinasas) por Fusarium oxysporum.
Continuación) Evaluación de la producción de enzimas degradantes de la pared celular vegetal (Pectinasas) por Fusarium oxysporum.
Evaluación de la resistencia de Fusarium oxysporum al estrés oxidativo in vitro
Efecto del estrés oxidativo inducido por dicloruro de 1,1'-dimetil-4,4'-bipiridilo sobre el crecimiento de los aislados F. Grado de resistencia al estrés oxidativo: 0: sin crecimiento micelial, 1: menos del 30% de crecimiento micelial en relación con control, 2: Crecimiento inferior al 75% con respecto al control, 3: Crecimiento superior al 75% con respecto al control. Evaluación de la resistencia de Fusarium oxysporum a fitoanticipinas de raíces y bulbos de nardo (Polianthes tuberosa).
Evaluación de la resistencia de Fusarium oxysporum a las fitoanticipinas de raíces y bulbo del nardo (Polianthes tuberosa)
Evaluación de la resistencia a fitoanticipinas de nardo de aislados de Fusarium oxysporum utilizando sensidídicos.
FAVR3FAVR3
FAVR3 FAVR3
Se realizó la evaluación de la patogenicidad de aislados de Fusarium oxysporum en plantas de nardo para caracterizar el proceso de infección in planta. Escala donde se observan síntomas de la enfermedad causada por Fusarium (escala 1-5), obtenida de la evaluación de la patogenicidad de aislados de Fusarium oxysporum. Evaluación de la patogenicidad de aislados de Fusarium oxysporum en plantas de Nardo (Polianthes tuberosa) 30 días después de la inoculación.
Desarrollo de la enfermedad de cada aislado después de 60 días de inoculación en plantas de Nardo (Polianthes tuberosa).
Producción de fitotoxinas por Fusarium oxysporum
A-1 y A-2 muestran una raíz con células viables y se marca con un círculo rojo el daño causado por las fitotoxinas en la parte de la raíz donde se aplicó. Las Figuras B-1, B-2 y C-1, C-2 muestran las diferencias entre una raíz que estuvo completamente expuesta a fitotoxinas (B-1 y C-1) y una raíz de control que no estuvo expuesta a fitotoxinas. extracto (B-2 y C-2), mostrando la raíz teñida viabilidad celular total mientras que la raíz tratada con fitotoxinas no mostró respiración ni reacción del indicador utilizado. Relación cualitativa entre evaluación de mecanismos de patogénesis in vitro y evaluación in planta.
Relación cualitativa entre la evaluación de los mecanismos de patogénesis in vitro y la evaluación in planta
Los mecanismos patogénicos más relevantes para esta interacción fueron el grado de colonización de las raíces, la producción de enzimas que degradan la pared celular (aquí asociada con PG) y su resistencia a las fitoanticipinas (aquí asociada con saponinas). PEDPC: Grado de producción de enzimas que degradan la pared celular, RROS: Grado de resistencia al estrés oxidativo, RSAP: Grado de resistencia a fitoanticipinas (saponinas), IPATiv: Índice de patogenicidad in vitro. Se obtuvieron 56 aislamientos de la rizosfera de cultivos silvestres de Polianthes de diferentes sitios de recolección y tipos de muestras (suelo, raíz y bulbo), además de muestras de tejido vegetal enfermo de cultivos comerciales de Polianthes tuberosa var.
Se seleccionaron 10 aislados para su caracterización y se denominaron POT1 a POT10. obtenido de Polianthes tuberosa y especies silvestres Polianthes sp.
Evaluación de antagonismo in vitro de los aislamientos de Trichoderma sp
Aislamiento de Trichoderma por Competencia por Nutrientes; G: Aislamiento de Trichoderma por competencia de nutrientes y micoparasitismo; H: Aislamiento de Trichoderma con producción de metabolitos o enzimas antifúngicos. Determinación del nivel de antagonismo in vitro de aislados seleccionados de Trichoderma contra Fusarium oxysporum (POF1). PENZ: Producción de enzimas antifúngicas; ANTB: presencia de antibióticos; COMPN: Presencia de competencia por nutrientes; RCRE: Crecimiento Acelerado.
Evaluación de la colonización de raíces de nardo (Polianthes tuberosa) por aislados de Trichoderma sp.
Para obtener el grado de antagonismo in vitro se dio un punto por cada uno de los mecanismos asociados, a excepción del micoparasitismo moderado y crecimiento acelerado a los que se les asignó 2 puntos y se sumaron todos los puntos.
Producción de enzimas antifúngicas (quitinasas y glucanasas) por aislamientos de Trichoderma spp
Efecto antifúngico de las quitinasas producidas por cada aislado de Trichoderma contra Fusarium oxysporum (POF1). Determinación de la tasa de producción de enzimas con actividad quitinasa para cada aislado de Trichoderma contra Fusarium oxysporum (POF1). Efecto antifúngico de las glucanasas producidas por cada aislado de Trichoderma contra Fusarium oxysporum (POF1).
Determinación del grado de producción de enzimas con actividad glucanasa para cada aislado de Trichoderma contra Fusarium oxysporum (POF1).
Producción de metabolitos secundarios de bajo peso molecular por aislamientos de Trichoderma spp
Actividad antifúngica de los metabolitos secundarios producidos por cada aislado de Trichoderma contra Fusarium oxysporum (POF1). Determinación del grado de producción de metabolitos secundarios con actividad antifúngica para cada aislado de Trichoderma contra Fusarium oxysporum (POF1).
Finalmente, para la evaluación in planta se obtuvo un índice de protección in planta para cada uno de los aislados de Trichoderma caracterizados (IPROTip). Índice de protección dentro del cultivo = [(Tasa de protección * Porcentaje de incidencia de la tasa de protección)-índice de protección del control negativo POF1]. Los valores numéricos se obtuvieron multiplicando el porcentaje de cada grado de protección por el grado de protección correspondiente.
Relación cualitativa entre la evaluación de mecanismos protectores in vitro y la evaluación in planta.
Relación cualitativa entre la evaluación de los mecanismos de protección in vitro y la evaluación in planta
Con base en la correlación cualitativa entre los índices de protección evaluados, no fue posible encontrar una correlación positiva a través de los índices obtenidos. Uno de ellos podría ser la inducción de mecanismos de defensa de las plantas, así como la naturaleza de la colonización de raíces por aislados de Trichoderma. Correlación cualitativa entre la evaluación de mecanismos de protección in vitro y la evaluación de protección in planta de aislados de Trichoderma sp.
ANTIv: Tasa de antagonismo in vitro; CR: Tasa de colonización de raíces; PQUIT: Tasa de producción de quitinasas con actividad antifúngica; PGLUC: Tasa de producción de glucanasas con actividad antifúngica;
Relación cualitativa entre los mecanismos de patogénesis de Fusarium oxysporum
Uno de los primeros fue la producción de enzimas que degradan la pared celular de las raíces. Vázquez et al, (1992) también evaluaron la producción de enzimas relacionadas con la degradación de la pared celular vegetal en tres aislados de Fusarium oxysporum. En este trabajo, por otro lado, se observó una colonización y producción suficientes de enzimas que degradan la pared celular, siendo un factor decisivo la gravedad de la enfermedad y la patogénesis encontrada en las plantas.
Esto se asoció con una baja colonización de las raíces y una baja producción de enzimas que degradan la pared celular.
Relación cualitativa entre los mecanismos de protección de Trichoderma evaluados in vitro con su protección in planta
Relación cualitativa entre los mecanismos de protección de Trichoderma evaluados in vitro con su protección in planta. En este trabajo la caracterización de los aislados fue únicamente a nivel de identificación morfológica y la caracterización de los mecanismos de protección asociados a Trichoderma a nivel in vitro. Los resultados mostraron un buen control de la colonización del patógeno con Trichoderma.
En el caso del micoparasitismo de Trichoderma sp., se considera uno de los mecanismos más estudiados, ya que es la observación más común de este tipo de interacción mediante pruebas de doble cultivo in vitro.
