Obtener una colección de cepas de hongos aisladas de residuos de café de la finca Argovia en Tapachula, Chiapas. Purificar parcialmente y caracterizar la actividad clorogenato esterasa obtenida a partir de cultivos en medio sólido de la cepa fúngica seleccionada.
Fundamentación
Hongos
- Aislamiento y clasificación de hongos
- Hongos filamentosos
- Condiciones de cultivo
- Nutrientes utilizados para el crecimiento de hongos
- Formulación del medio de cultivo
- Hongos con aplicaciones industriales
- Hongos aislados del café (pulpa y cascarilla)
El uso de hongos en medicina es muy diverso, para la producción de antibióticos, entre los que la penicilina es uno de los más importantes. Los hongos producen más de 4.000 antibióticos diferentes, siendo Penicillium uno de los géneros más importantes en la producción de antibióticos.
Ácidos fenólicos
- Ácidos Fenólicos presentes en los residuos del café
- Propiedades biológicas de los ácidos fenólicos
- Propiedades biológicas de derivados naturales y sintéticos del ácido
Varios estudios han informado de modificaciones de los ésteres del ácido cafeico para alterar su actividad biológica. Además, se informó la presencia de éster 2-etílico (2-etoxietoxi) del ácido cafeico producido por transesterificación cuando se coadministraron alcoholes con FEAC in vivo (Celli, Dragani et al. 2007).
Procesos fermentativos para la producción de enzimas
- Fermentación sumergida o líquida
- Fermentación en medio sólido
- Ventajas y desventajas de la FMS con respecto a la FS
- Tipos de fermentadores para FMS
Este biorreactor trabaja con un volumen de un litro, cuenta con un muestreador de humedad relativa y un sistema de calentamiento en la parte superior de la columna (Figura 1.1). En 2001, se propuso un proceso FMS basado en la producción continua de enzima tanasa (van de Lagemaat y Pyle, 2001).
Enzimas
- Clasificación de la enzimas
- Lipasas
- Tanasas
- Feruloil esterasas
- Clorogenato esterasas
- Purificación de enzimas
- Métodos para la purificación de proteínas
- Purificación intermedia de proteínas
- Pulido de proteínas
Alta disponibilidad de sustrato, debido al movimiento de la capa de agua alrededor de las moléculas de lípidos. 31 Figura 1.12 Hidrólisis de triacetina por esterasa de hígado de caballo y lipasa pancreática de cerdo. La Figura 1.12 compara la hidrólisis de triacetina por dos enzimas con la misma función catalítica.
Cuando se excede la solubilidad de la triacetina (el sustrato forma una emulsión), el área interfacial aumenta y se observa un aumento notable en la actividad enzimática (Figura 1.12 b). Estas enzimas liberan ácido ferúlico (AG) y ácido diferúlico de la hemicelulosa y pectina de la pared celular de la planta (Figura 1.15). Estas enzimas no liberan diferulados y muestran similitud de secuencia con las acetil xilano esterasas de la familia 1.
Métodos de búsqueda y selección para carboxil éster hidrolasas
- Métodos clásicos de búsqueda y selección
- Métodos de búsqueda y selección para lipasas
- Métodos de búsqueda y selección para tanasas
- Métodos de búsqueda y selección para FAEs
- Métodos de búsqueda y selección para CEs
- Métodos de selección de alto rendimiento
- Métodos de SAR para lipasas
- Métodos de SAR para tanasas
- Métodos de SAR para FAEs
- Métodos de SAR para clorogenato esterasas
Se han utilizado con éxito 45 SAR fisicoquímicos e inmunológicos para medir la actividad de la lipasa (Beisson, Arondel et al. 2000). La actividad CE se puede medir después de la hidrólisis del ácido clorogénico, mediante la aparición de ácido cafeico mediante HPLC (Kishimoto, Kakino et al. 2005). Sin embargo, la actividad de EC generalmente se determina mediante el método descrito por Ralet et al.
La actividad se calcula a partir de la diferencia relativa de absorbancia a 335 nm entre los ácidos fenólicos libres y el éster correspondiente. Para la determinación de la actividad CE, el método que se utilizó es el desarrollado por Ralet et al., en el que se mide la diferencia relativa de absorbancia a 335 nm de los ácidos fenólicos libres y su correspondiente éster (Asther, Estrada Alvarado et al. 2005; Adachi, Ano et al. 2008). Por lo tanto, es altamente deseable un método SAR práctico para este tipo de enzimas (Mateos, Rivera et al. 2009).
Materiales y Métodos
Microorganismos
- Aislamiento y conservación de cepas
- Identificación de cepas fúngicas
Producción de clorogenato esterasas
- Soportes y sustratos sólidos para las fermentaciones
- Bagazo de caña
- Residuos del café
- Producción de esterasas por FMS
- Solución de oligoelementos empleada en el medio de cultivo
- Dispositivo de FMS
- Extracción enzimática del medio de FMS
Del paso anterior (CIH), se combinaron las fracciones que mostraban mayor actividad clorogenato esterasa (130 ml). La Figura 4.4 muestra los efectos de la temperatura y el pH sobre la actividad y estabilidad de la clorógeno esterasa presente en un extracto crudo. SDS (10% acrilamida) de clorógeno esterasa producida por FMS en las distintas etapas de purificación.
En la Figura 5.6 se puede ver el zimograma producido a partir de las diferentes etapas de purificación de la clorogenato esterasa. Los perfiles de actividad en función de la temperatura de la clorogenato esterasa se muestran en la Figura 5.8a. Se recomienda utilizar un diseño experimental para investigar la producción de clorogenato esterasa a partir de A.
Técnica analíticas
- Preparación de la muestra
- Cuantificación simultánea de la actividad tanasa, feruloil y clorogenato
- Determinación de actividad clorogenato esterasa por espectrofotometría. 57
- Determinación de proteína
- Preparación del reactivo de azul de Coomassie
- Curva estándar de proteína
Purificación de la clorogenato esterasa…
- Extracción por percolación
- Tratamiento del extracto fermentado de la FMS
- Métodos cromatográficos para separación de proteínas…
- Cromatografía de Interacción Hidrofóbica
- Cromatografía de intercambio iónico
- Cromatografía de exclusión por tamaño molecular (filtración en
- Determinación del peso molecular
- Electroforesis
- Electroforesis SDS-PAGE
- Electroforesis en condiciones nativas
- Tinción de geles con Azul de Coomassie
- Tinción de geles con plata
- Zimograma
El extracto crudo se aplica en la parte superior de la columna y gradualmente ingresa a la columna junto con la fase móvil. La producción de proteínas de la columna se observa espectrofotométricamente a una longitud de onda de 280 nm. Para la elución, se realiza un cambio en la fuerza iónica en la fase móvil para tener un efecto más sutil.
La desorción de las proteínas adsorbidas en la matriz de la columna se realizó utilizando un gradiente isocrático de 5 CV de NaCl (0,2 M) con un caudal de 1 ml min-1 y recolección de fracciones de 5 ml. Esta técnica se basa en la propiedad de la molécula de entrar en los poros del gel envasado. Luego, el gel concentrador se preparó de la misma manera que el gel separador.
Efecto de la temperatura y el pH sobre la actividad y estabilidad de la
Se eliminó el agua del último lavado mientras se mezclaban B y C y se distribuyó la mezcla en cada bandeja. Se continuó agitando, teniendo cuidado después de 5 minutos, tiempo en el que se desarrolla la coloración. Cuando se detectaron visualmente las bandas de interés, se descartó la solución de tinción y se aplicó la solución de parada (solución D).
Para la detección de la actividad clorogenato esterasa se utilizó un zimograma, el descrito por Singh (Singh, Gupta et al. 2006), con algunas modificaciones. Se inyectaron muestras y el gel se procesó con 1x Running Buffer, a 4°C. Después del pase, el gel se colocó en agua destilada y se agitó durante 10 min, se realizó otro lavado y finalmente se eliminó el agua y el gel se colocó en Tampón de Activación (2,5 mM MOPS, pH 7,2) a 30 °C y se colocó en parte superior del gel del sustrato hasta que se observe la apariencia del halo amarillo.
Efecto de diversos efectores sobre la actividad
Implementación de un método de screening para la selección de cepas
- Identificación de los hongos
- Validación del método
- Método para la detección simultánea de las actividades feruloil esterasa,
- Conclusiones
Por otro lado, se darán los resultados obtenidos de la validación del método de screening para la determinación de las actividades tanasa, feruloil, clorogenato esterasa y lipasa, que fueron aplicados a las diferentes cepas obtenidas mediante aislamiento. El principio del método para la detección simultánea de diferentes actividades hidrolíticas, que se utilizó en este trabajo, se basa en monitorear el color amarillo del indicador de pH, p-nitrofenol (pNF), monitoreado a 415 nm. La disminución de la absorbancia a 415 nm causada por la protonación del indicador de pH seleccionado fue lineal durante 120 minutos durante toda la cinética de hidrólisis (Figura 3.1A).
Al momento de agregar diferentes concentraciones de enzima (Rapidase UF, de DSM), la velocidad de reacción aumentó lineal y proporcionalmente, lo que indica que la velocidad de reacción catalizada por la enzima es proporcional a la concentración total de la enzima agregada (Figura 3.1B) . La tasa de hidrólisis del ácido clorogénico aumentó con el aumento de la cantidad de enzima. 87 El perfil enzimático y las actividades enzimáticas máximas variaron dependiendo de la cepa de hongos utilizada en FMS (Figura 3.3).
Producción selectiva de clorogenato esterasa por fermentación en medio sólido… 91
- Efecto de la composición del medio de cultivo sobre la síntesis de
- Efecto de la fuente de nitrógeno sobre la actividad clorogenato esterasa
- Efectos de la temperatura y pH sobre la actividad clorogenato esterasa y la
- Hidrólisis enzimática del ácido clorogénico presente en los residuos del café. 101
95 4.2 La influencia de la composición del medio sólido en la síntesis de clorogenato esterasa. En la mezcla de cáscara de café/BCA, la actividad clorogenato esterasa fue mayor en ambos experimentos con y sin adición de glucosa. Estos resultados nos llevaron a estudiar el efecto de la cascarilla de café en la síntesis de clorogenato esterasas por FMS.
Por lo tanto, la cáscara de café fue probablemente un mejor inductor de la actividad de la clorógeno esterasa en comparación con la pulpa. 103 También se observó que la adición de glucosa suprimió la síntesis de feruloil esterasa y aumentó la producción de clorógeno esterasa. La combinación de cascarilla de café y glucosa favoreció la producción selectiva de clorógeno esterasa por parte de A.
Purificación y caracterización bioquímica de la enzima clorogenato esterasa
Purificación de clorogenato esterasa
- Cromatografía de interacción hidrofóbica
- Cromatografía de intercambio iónico
- Cromatografía de exclusión
- Estudio de purificación
- Análisis de electroforesis
- Zimograma
Se utilizó cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) para el primer paso del protocolo de purificación de la enzima clorogenato esterasa. La Figura 5.1 muestra que la actividad clorogenato esterasa se eluye a la mitad del gradiente de SA descendente, por lo que podemos suponer que la hidrofobicidad de la proteína es intermedia. El segundo paso del protocolo fue el uso de cromatografía de intercambio iónico (IIC).
La mayor parte de la actividad CE (>90%) se eluyó en la parte superior, justo después de la estabilización de la columna con una concentración de NaCl 0,2 M. Marcadores de peso molecular, 1) extracto de FMS, 2) eluyente de columna de fenilsefarosa, 3) eluyente de columna de DEAE y 4) eluyente de columna de Superdex. El método presentado en este trabajo para la detección de clorogenato esterasa es simple y se puede aplicar a extractos enzimáticos crudos y preparaciones purificadas en placas o geles de electroforesis.
Caracterización bioquímica
- Filtración en gel
- Influencia de la Temperatura sobre la actividad y estabilidad de la CE
- Influencia del pH sobre la actividad y estabilidad de la CE de A
- Efecto de iones metálicos, detergentes e inhibidores sobre la actividad
Para estudiar el efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática, la actividad se midió a diferentes temperaturas de reacción entre 20 y 70°C. Figura 5.8 Efecto de la temperatura sobre la actividad de la clorogenato esterasa purificada producida en FMS. a) Actividad medida en un rango de 20-70°C. b) Representación de Arrhenius: el logaritmo de la actividad en función de la inversa de la temperatura en °K. La influencia del pH sobre la actividad CEAo producida por FMS se estudió a 40°C, en un rango de pH entre 4 y 9 (Figura 5.10).
Para caracterizar y comprender mejor la enzima, se estudió la acción de diversos metales y compuestos; así como inhibidores de serina sobre la actividad enzimática de la clorogenato esterasa de A. De los iones metálicos utilizados, sólo Co2+ y Mn2+ aumentaron la actividad enzimática (9 y 12%, respectivamente); mientras que el ion Hg2+ redujo la actividad clorogenato esterasa en un 48%. Los detergentes no aumentaron la actividad enzimática; El SDS, por otro lado, tuvo un efecto inhibidor.
Conclusiones…
34; Feruloyl Esterase from Aspergillus niger Comparison of Solid State Production and Submerged Fermentation." Process Biochemistry. 34; Purification and Characterization of Feruloyl Esterase from Penicillium expansum." Journal of Applied Microbiology. 34; Microbial production of gallic acid by modified solid state fermentation.” Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology.
34;Production of tannase from Aspergillus ruber under solid state fermentation using jamun (Syzygium cumini) leaves." Microbiological Research. 34;Further characterization of a Chlorogenic Acid Hydrolase from Aspergillus-Niger." Zeitschrift Fur Naturforschung C-a Journal of Biosciences. 34; Isolation and Characterization of a Chlorogenic Acid Esterase from Aspergillus-Niger.” Zeitschrift Fur Naturforschung C-a Journal of Biosciences.
34;Purification and characterization of a Fusarium oxysporum feruloyl esterase (FoFAE-I) that catalyzes transesterification of phenolic acid esters." 34;Sporotrichum thermophilic type C feruloyl esterase (StFaeC): purification, characterization and its use for phenolic acid (sugar) acid ester synthesis."
