Utilizando un diseño factorial 23, se evaluó la actividad hidrolítica de los lisados de membrana dependiendo de los factores pH, temperatura y voltaje. Actividad hidrolítica de la enzima Novozyme 188 y el lisado de membrana de Candida tropicalis en harina de limón persa.
Objetivo general
Objetivos específicos
Industria citrícola
Composición celulósica de los principales residuos cítricos generados en la industria
8 materias primas, se debe a los carbohidratos presentes en su estructura, lo cual es comparable a lo reportado para otras materias primas utilizadas en la producción de biocombustibles de segunda generación (tabla 1).
Expectativas del aprovechamiento del material celulósico obtenido de residuos de limón
Principales polisacáridos susceptibles a sacarificar para su posible aprovechamiento
La solubilización de hemicelulosa se puede llevar a cabo a 150°C en condiciones neutras y a 120°C en presencia de ácido diluido (Hendriks et al., 2009). 11 Finalmente, la lignina es un polímero tridimensional compuesto de unidades fenilpropanoides (p-hidroxifenilo, guaiacilo y siringilo) unidas por enlaces éter y carbono-carbono (Figura 4) (Banoub et al., 2007).
Principales pretratamientos empleados previos a la sacarificación
Sin embargo, estos últimos no siempre tienen la capacidad de degradar la celulosa cristalina porque su sistema enzimático está incompleto (Brijwani et al., 2010). Actualmente, el procedimiento no puede generalizarse para el pretratamiento de diversos materiales celulósicos, porque el tratamiento debe ser específico teniendo en cuenta la composición de la biomasa relevante (Hahn-Hagerdal et al., 2006).
Principales enzimas que participan en la sacarificación de celulosa
El proceso de liberación de glucosa a partir de la celulosa se describe en la Figura 6. 16 las propiedades físicas y la composición del sustrato, el nivel de cristalinidad de la celulosa, el grado de polimerización en la biomasa y la sinergia de los complejos multienzimáticos (Shaikh et al., 2011).
Celulosomas
Estos celulosomas son una alternativa viable para la producción de ciertos productos deseados, como el bioetanol (Bayer et al., 2007). El uso de preparaciones de enzimas de celulosa libres de células, es decir; en forma de lisados de membrana y de cepas aisladas de residuos agrícolas han sido de gran ayuda para llevar a cabo la hidrólisis, logrando mejores resultados en comparación con el uso de preparados enzimáticos de cepas comerciales (Tachaapaikoon et al., 2011).
Actividad hidrolítica específica (UI)
19 se cultiva en xilano y CMC, se observa que la actividad hidrolítica es mayor en enzimas extracelulares (Chung et al., 2010). Estos minicelulosomas mostraron mayor actividad hidrolítica para la sacarificación de Avicel y celulosa amorfa regenerada en comparación con las enzimas libres, que carecían del dominio de anclaje (You et al., 2012).
Enzimas hidrolíticas empleadas a nivel industrial
Solicitudes de patentes para procesos de sacarificación de diversos materiales celulósicos Número de solicitud Autores y año Tipo de enzimas Sustrato utilizado Condiciones de. Solución que contiene únicamente dominios de unión a celulosa (CDB) de enzimas.
Aislamiento de microorganismos
Identificación de microorganismos
23 Los fragmentos resultantes se amplificaron con la enzima ADN polimerasa Platinum Taq (Invitrogen). Los fragmentos amplificados se clonaron en el vector pCR2.1 (kit de clonación TA, Invitrogen), se secuenciaron con el programa Blast y se identificaron por nombre genérico y/o específico según su porcentaje de similitud con lo informado en la base de datos. .
Medios de cultivo
Para activación de microorganismos preservados
Para inducir formación de celulosomas
Adicionada con harina de limón persa (Citrus latifolia)
Preparación de gliceroles de conservación
Determinaciones analíticas
- Medida de población y masa celular
- Determinación de proteína
- Determinación de azúcares reductores libres (ARL)
- Determinación de azúcares totales (AT)
- Determinación de glucosa y sacarosa
- Determinación del perfil de azúcares
- Determinación del porcentaje de sacarificación
La determinación de azúcares reductores libres se realizó utilizando una muestra de 500 L del sobrenadante, utilizando el método del ADN (Miller, 1959). Para estimar la concentración de ARL en las muestras se preparó una curva de calibración de dextrosa anhidra en un rango de concentración de 0.1 a 1 g/L, las muestras y la curva de calibración se midieron en un espectrofotómetro a 550 nm (anexo 3). La determinación de azúcares totales se realizó utilizando una alícuota de 250 L del sobrenadante, utilizando el método de Dubois (Dubois, 1956).
Para estimar la concentración de AT en las muestras se preparó una curva de calibración de sacarosa en un rango de concentración de 0.01 a 0.1 g/L, las muestras y la curva de calibración se midieron en un espectrofotómetro a 492 nm (Apéndice 4).
Residuos de limón persa (Citrus latifolia)
- Pretratamiento de residuos de limón persa (Citrus latifolia)
- Análisis proximal de harina
- Hidrólisis ácida de harina
- Hidrólisis enzimática de harina
- Determinación de actividad hidrolítica específica (UI)
- Cinética de crecimiento de microorganismos
La actividad hidrolítica específica de las enzimas extracelulares y de membrana -endoglucanasa y -glucosidasa se expresó en unidades internacionales (UI) según la fórmula 5. Luego, las células se centrifugaron a 4 °C, 4700 rpm durante 30 minutos para separar el sobrenadante. y el sedimento para realizar análisis adicionales de actividad hidrolítica extracelular o peso seco. Además, se tomaron muestras de 5 ml, se centrifugaron y el sedimento resultante se lavó con solución salina y luego con NaOH al 0,1% para lograr la lisis celular preliminar y eliminar las proteínas celulares internas mediante una centrifugación posterior, asegurando la actividad hidrolítica de la membrana. no se vieron afectados por las enzimas intracelulares libres.
La determinación de la actividad hidrolítica específica de cuatro microorganismos se realizó sobre la base de un diseño experimental 4x2, en el cual se evaluaron los factores: el tipo de microorganismo con cuatro niveles (Xer 10, Xer 13, Xer 19 y T-7) y el sustrato. con dos niveles (CMC y celobiosa).
Observación de microorganismos por microscopía electrónica de barrido (MEB)
Obtención de lisados membranales y determinación de actividad hidrolítica específica 32
Se obtuvo 33 lisados, se utilizó un diseño factorial 23, los factores y sus niveles de prueba en las unidades originales se muestran en la Tabla 8.
Determinación de actividad hidrolítica del lisado membranal seleccionado, sobre
Aislamiento, identificación de microorganismos y preparación de gliceroles de
Se ha reportado que esta bacteria no tiene la capacidad de fermentar la celulosa, por lo que se asumió que tampoco puede descomponerla o que puede hacerlo en una cantidad mínima solo para su supervivencia (Chandel et al., 2011). Como ejemplo podemos mencionar la asociación entre la bacteria Fibrobacter succinogenes y una cepa identificada como Acinetobacter sp durante el proceso celulolítico (Shinkai et al., 2010). Esta cepa fue identificada como Klebsiella pneumoniae mediante técnicas moleculares y sus características genotípicas fueron consistentes con la cepa no patógena (Aung et al., 2013).
Por otro lado, se ha documentado que la degradación de la celulosa por las termitas es un proceso realizado por enzimas producidas extracelularmente en el estómago y diversas partes del intestino, enzimas que pueden corresponder al metabolismo de ciertos protozoos y/o bacterias ( Hogan et al., 1987).
Muestreo y pretratamiento de residuos de limón persa (Citrus latifolia)
Hidrólisis ácida de harina
Teniendo en cuenta la concentración de azúcar en la harina de residuo de limón, se propuso realizar una hidrólisis con ácido diluido, considerándolo como un pretratamiento alternativo antes de la sacarificación con el lisado de membrana. 40 Según el análisis estadístico de ANOVA (Tabla 12), se observó un efecto significativo debido a la concentración de HCl y la temperatura sobre la cantidad de azúcares totales liberados durante la reacción. La primera interacción indica que no hay diferencia en la cantidad de azúcares totales cuando se utiliza HCl 0,1% en cualquiera de las tres temperaturas, con una concentración de 4 g/kg de harina y aumentando a 8 g/kg de harina si ese es el caso. . es el caso. utilizado, la concentración del 1%.
En cuanto a la concentración de ácido al 3%, se puede observar que la concentración se mantiene en 6 g/kg de harina a temperaturas de 25 y 40 °C, pero a 120 °C aumenta significativamente hasta 26 g/kg de harina.
Hidrólisis enzimática de harina
43 función de la concentración de enzima agregada y el tiempo, obtuvieron un máximo de 405 g de glucosa por kg de harina a las 24 horas cuando se agregó Novozyme 188 en su mayor concentración, mientras que con la enzima Celluclast 1.5L a la misma concentración, 196 g de glucosa por Se obtuvieron kg de harina. Para expresar más claramente la relación entre la concentración de glucosa liberada y la cantidad de proteína utilizada, se determinó la producción de glucosa por g de proteína independientemente de la cantidad de harina tratada. Es relevante señalar que solo se observó un aumento en la producción de glucosa con el tiempo, cuando la concentración de enzima añadida era baja, para todas las enzimas.
El efecto de cada factor se verificó mediante análisis estadístico. La Figura 19 muestra el diagrama de Pareto que muestra que el tipo de enzima, su concentración y su interacción tienen un efecto significativo en la producción de glucosa.
Determinación de actividad hidrolítica específica de cuatro microorganismos
Cinética de crecimiento de microorganismos
Respecto al crecimiento, se observó que la mejor determinación se obtuvo utilizando la densidad óptica (D.O.), ya que las mediciones de peso seco y población celular mostraron mayor variabilidad entre cada uno de los tiempos de crecimiento medidos. La Figura 22 muestra las curvas de crecimiento obtenidas para levaduras cultivadas en CMC y celobiosa (T-7 y Candida tropicalis). Se observa que la curva correspondiente a la determinación del crecimiento por población para la cepa T-7 tiene un comportamiento atípico, ya que no se observan los estadios característicos de una curva de crecimiento microbiano, mientras que para Candida tropicalis se observa una mejor definición de cada uno de los estadios. de crecimiento.
En la Tabla 15 se muestran los valores máximos de crecimiento obtenidos para cada una de las cepas en los dos medios diferentes utilizando los tres métodos mencionados anteriormente.
Actividades hidrolíticas específicas de microorganismos
Siguiendo el mismo patrón de disminución de la actividad de la membrana cuando se alcanza la fase estacionaria de crecimiento. Para conocer con mayor detalle las cepas evaluadas se calcularon dos parámetros cinéticos: tasa de crecimiento (μ) y tiempo de duplicación (td) en cada uno de los sustratos probados, los resultados se presentan en la tabla 17. Estos parámetros cinéticos muestran que los picos tienen una tasa de crecimiento mayor a pesar de que la literatura menciona que las bacterias son generalmente los microorganismos de más rápido crecimiento.
Esquema de la interacción entre la cepa y el sustrato en el sistema de membranas con intervalos LSD superpuestos.
Observación por microscopía electrónica de barrido (MEB)
61 En contraste, la Figura 33 presenta la misma interacción sustrato-cepa, donde se observa que la actividad hidrolítica de la membrana aumenta significativamente cuando se usa la misma levadura T-7 en celobiosa, hasta UI=58.
Obtención de lisados membranales y determinación de actividad hidrolítica específica 62
Previamente se realizó un análisis multifactorial de varianza para probar estadísticamente si existe alguna diferencia significativa debido a los factores pH y temperatura sobre la actividad hidrolítica de las enzimas del lisado de membrana de la cepa T-7. Lo que se observó para ambas cepas fue que solo estaba presente la actividad hidrolítica de la enzima -endoglucanasa. Se observó mayor actividad en el lisado de la cepa Candida tropicalis, con hasta UI=0,69 y UI=0,65 a pH 8 a 30 y 37°C respectivamente.
Perfil de azúcar de la sacarificación del aceite de limón persa con el lisado de membrana de la cepa Candida tropicalis.
Hidrólisis en dos etapas de harina de limón persa (Citrus latifolia)
La acción del lisado de membrana de la cepa Candida tropicalis contribuyó a un ligero aumento de la concentración de azúcares, pero no se observó una liberación de más de 50 g de glucosa. Inicialmente, el uso de la enzima Novozyme 188 en una concentración de 33,8 g de proteína por kg de harina para alcanzar una concentración de glucosa de 405 g por kg de harina. La sacarificación de la harina de limón utilizando el lisado de membrana y las mejores condiciones para la hidrólisis ácida como pretratamiento, permitió obtener un máximo de 68 g de azúcar total por kg de harina (glucosa, xilosa y galactosa).
La sacarificación de harina de limón utilizando lisado de membrana y las mejores condiciones de hidrólisis ácida y enzimática permitieron obtener un perfil de azúcar compuesto por glucosa, xilosa, galactosa, arabinosa y fructosa y un porcentaje de sacarificación fue del 49,9%.
Preparación de soluciones
Método de Lowry
Método de Miller et al., 1959 (Ácido dinitrosalicílico, DNS)
Método de Dubois et al., 1956 (Fenol-sulfúrico)
Presentaciones en congresos
Biotechnology Summit, 2012
Seminario Nacional de los Estudiantes del PICyT, 2012
National Congress of Biotechnology and Bioengineering, 2013
Reunión Nacional de Bioenergía, 2013