MANUAL DIAGNOSTICO ENFERMEDADES DEL CAMARON

Con unas pinzas de disección finas, retire algunos de los túbulos de la región media y colóquelos sobre una gota de agua de mar limpia en un portaobjetos de vidrio. Si se sospecha la presencia de BP, se puede realizar otra preparación añadiendo una gota de verde de malaquita al 0,01%.

Soluciones fijadoras aceptables

Selección y colecta de las muestras Los camarones pueden ser capturados usando

Muestreo no aleatorio en casos de enfermedad

Muestreo para histología normal Aquellos camarones que sean muestreados

Fijación o Preservación

Proporción Volumen-Tejido

MANUAL PARA EL DIAGNÓSTICO DE ENFERMEDADES DEL CÁNCER. ml, se deben utilizar 100 ml de solución fijadora).

Preparación de la solución fijadora de Davidson (Alcohol-Formalina-Acido A-

Procedimientos para la fijación con solución de Davidson (AFA)

Debido a que las notas escritas con tinta se pueden borrar con alcohol, es necesario utilizar un lápiz, especialmente si las notas se incluirán en las muestras. También se recomienda utilizar papel que no se desintegre por la acción del alcohol (por ejemplo, papel plástico). 2.2.6 Transporte para procesamiento 1) Retire los camarones de la solución.

Preparación para el embebido

En el caso de que se necesite un órgano, sistema o área en particular, los cortes realizados durante la disección deben ajustarse para que coincidan con esas áreas.

Infiltrado en parafina

Procesamiento de tejidos en un procesador automático

Embebido

Corte

Equipo

Procedimientos especiales

Tinción - H&E de rutina

Hematoxilina-Eosina/Floxina (H&E) de Mayer-Bennett

Hematoxilina-Eosina de Harris (H&E)

Preparación de muestras para pruebas de tipo serológico y de hibridación con sondas ge-

Fundamento

Materiales y métodos

Solución amortiguadora “TN”
Preparación de muestras homogeni- zadas
Preparación de muestras de hemo- linfa
Preparación de la prueba de “Dot Blot”

El interior de la aguja, que se utilizará para obtener hemolinfa, está recubierto con citrato de sodio al 10%. En el caso de una transferencia puntual, puede utilizar la muestra de hemolinfa directamente y aplicar una o dos gotas a la membrana de prueba o diluirla antes de la aplicación.

Prueba de hibridación con sondas genéticas en formato “dot blot”

Fundamento
Preparación de las muestras (ver Seccción 2.3)
Procedimiento (para el tipo de reactivos necesarios, ver Sección 2.4.4)
Reactivos necesarios para la hibridación en formato “Dot-Blot”
Resolución de problemas

Para preparar el tampón I a una concentración de 1x, diluya 100 ml de la solución madre (10x) en 900 ml de agua bidestilada; filtrar a 0,45 µm; mantener a 4ºC. Para preparar el tampón intravenoso a una concentración de 1x, diluya 100 ml de solución madre (10x) en 900 ml de agua bidestilada; filtrar a 0,45 µm; Esta solución debe almacenarse a 4oC.

Prueba de hibridación con sondas genéticas en formato “in situ”

Fundamento
Preparación de las muestras
Procedimiento
Reactivos

Diluir la sonda a una concentración de 10-25 ng/ml en solución de hibridación y cubrir la muestra con 0,5 ml de la solución. Con los portaobjetos en posición horizontal, cubrir la muestra con 0,5 ml de la solución bloqueadora.

Método de PCR (Polymerase Chain Reaction/Reacción en Cadena de la Polimerasa)

Fundamentos
Preparación de la muestra
Secuencias de los inciadores
Protocolo de temperaturas
Mezcla de reactivos (“Ready to Go Beads”/ “Reactivos Listos para Usarse”)
Visualización

Luego, la muestra se cicla 39 veces bajo el siguiente protocolo de temperatura: 94oC durante 1 minuto, recocido a 60oC durante 1 minuto y polimerización a 72oC durante 3 minutos. Después del último ciclo, la muestra se polimeriza durante otros 7 minutos a 72oC y finalmente se mantiene a 4oC durante 5-10 minutos.

Método de RT-PCR para la detección de patógenos

Fundamento
Preparación de la muestra
Secuencias de los iniciadores
RT-PCR. Protocolo de temperaturas
Mezcla de reactivos RT-PCR (Ready to Go Beads/Reactivos Listos para Usarse)
Visualización
Nombre de la enfermedad y del agente etiológico

Agente
Métodos preferidos actualmente para la detección del patógeno

Rango geográfico de distribución y especies afectadas

Rango geográfico
Especies afectadas

Síntomas clínicos de importancia diag- nóstica

P. stylirostris
P. vannamei

Procedimientos de diagnóstico en casos de enfermedad

Diagnóstico presuntivo
Métodos para la detección y el diagnóstico definitivo del virus

Procedimientos no letales para el análisis de reproductores

El volumen final de la reacción es de 50 µl, que incluye 10,0 µl de ARN extraído de la muestra a analizar. 3 ENFERMEDADES DE ORIGEN VIRAL 3.1 Virus de la necrosis hipodérmica y hematopoyética infecciosa (VNHI). Normalmente, la gravedad de la infección por IHHNV se informa en una escala de 0 a 4.

Generalmente la porción acelular de la cutícula del camarón (infectada por el VNHI o no) adquiere un color azul. El diagnóstico positivo de IHHNV se basa en la presencia de un precipitado negro azulado o violeta en el sitio de la membrana donde se inmoviliza la muestra. La intensidad del color del precipitado depende de la concentración de ácidos nucleicos virales en la muestra (ver figuras adjuntas).

IHHNV

Parvovirus Hepatopancreático (HPV) .1 Nombre del agente etiológico y de la

Agente
Métodos preferidos actualmente para el diagnóstico

Rango geográfico

Síntomas clínicos de importancia diagnóstica
Procedimientos de diagnóstico en ca- sos de enfermedad

Métodos para la detección y el diagnóstico definitivo del virus

También se ha observado en Macrobrachium rosenbergii un tipo de VPH (o un agente muy similar no relacionado con el VPH del camarón peneido). Al inicio de su formación, los cuerpos de inclusión del VPH tienen la forma de pequeños cuerpos eosinófilos situados en la parte central del núcleo, muy cerca del nucléolo. La sensibilidad diagnóstica de la técnica de Giemsa para la tinción de huellas de hepatopáncreas es muy cercana a la alcanzada por la histología (60% a 100% de sensibilidad diagnóstica en comparación con la de la histología, ver por ejemplo las figuras adjuntas).

La equivalencia entre la sensibilidad diagnóstica del método de Giemsa y la de la histología es mejor cuando tanto la prevalencia como la gravedad de la infección por VPH son altas, pero es menor cuando estos valores son bajos (sólo 50% o menos de sensibilidad). la gravedad o la prevalencia es baja). Los primeros cuerpos de inclusión del VPH se observan como pequeñas inclusiones eosinófilas asociadas con el nucléolo. Las sondas genéticas A-1.9 y S-2.0, denominadas DIG y específicas para la detección del VPH, se consideran una herramienta extremadamente sensible para la detección del VPH.

Virus del Síndrome de la Mancha Blanca (WSSV)

Nombre del agente etiológico y de la enfermedad

Rango geográfico

Métodos para la detección y el diag- nóstico definitivo del virus

Se ha informado del virus del síndrome de la mancha blanca en las regiones geográficas siguientes. Después de surgir en el noroeste de Asia en 1992-1993, este virus se ha extendido rápidamente por la mayoría de las zonas de cultivo de camarón en Asia y el Indo-Pacífico. ¾ Demostración de núcleos hipertróficos y vacuolados, visibles en preparaciones o impresiones de tejido epitelial y conectivo del estómago y/o branquias, en camarones que muestren signos clínicos de la enfermedad como se describe en la sección 3.1.3.

¾ Sin embargo, durante la etapa más avanzada de la infección por WSSV, los tejidos infectados exhiben cuerpos de inclusión más grandes y más desarrollados, no exhiben un halo y tienen un color basófilo pálido, lo que los hace fácilmente distinguibles de los cuerpos de inclusión. Utilice unas pinzas de punta fina para pelar la capa epitelial de la cutícula del estómago (o de la cubierta branquial) y colóquela en el portaobjetos. Los primeros cuerpos de inclusión muestran una gran similitud con los cuerpos de inclusión de tipo Cowdry A que aparecen como resultado de la infección por IHHNV.

Virus del Síndrome de Taura

Nombre del agente etiológico y de la enfermedad

Agente
Métodos preferidos actualmente para la detección y el diagnóstico

Rango geográfico

Síntomas del síndrome de Taura

Métodos para la detección y el diag- nóstico definitivo del virus

¾ El diagnóstico histológico de la enfermedad (con tinción H&E), durante la fase aguda/sobreaguda, se basa en la demostración de áreas de necrosis. Muy raramente se ve afectado el epitelio de los túbulos de las glándulas antenas. La ausencia de infiltración hemocítica, o de cualquier otro tipo de respuesta inflamatoria, distingue la fase hiperaguda de la fase convaleciente o crónica de la enfermedad.

¾ Durante la fase de recuperación o crónica de la enfermedad, las lesiones cuticulares se asemejan a las causadas por una infección bacteriana de la cáscara (“enfermedad de la cáscara”) (ver figuras adjuntas). ¾ Durante la recuperación o la fase crónica de la enfermedad, es común observar la presencia de estructuras dentro del órgano linfoide conocidas como "esferoides" (ver figuras adjuntas). ¾ La sonda genética para la detección de TSV está disponible comercialmente a través de DiagXotics, Inc.

MUERTE

RECUPERACIÓN/

PORTADOR DE TSV?

MUERTECICLO

DE MUDA

TSV PER-

TSV CRÓNICO

Virus del síndrome de la cabeza amarilla

Nombre de la enfermedad y del agente etiológico
Agente

Rango geografico

Síntomas Clínicos de Importancia Diagnóstica

Diagnóstico presuntivo .1 Historial y signos clínicos
Diagnóstico definitivo

Inicialmente, algunos investigadores tailandeses informaron que el YHV era un baculovirus citoplasmático tipo B (virus de la granulosis) o un virus similar al baculovirus y le asignaron el nombre de baculovirus de cabeza amarilla o YHB. ¾ El virus de la cabeza amarilla es un virus de ARN monocatenario (ssRNA), tiene forma cilíndrica, tiene envoltura y se reproduce citoplasmáticamente. Aunque la enfermedad de la cabeza amarilla fue reconocida y descrita por primera vez en camarones de Tailandia hasta hace relativamente poco tiempo, es probable que YHV fuera el mismo síndrome que afectaba a P.

El YHV puede haber sido responsable del colapso de la industria de Taiwán y de epizootias más pequeñas pero graves en regiones productoras de P de Indonesia, Malasia, China y Filipinas. Al cabo de un día es posible observar algunos camarones moribundos nadando lentamente cerca de la superficie. a orillas de los estanques. Si las muestras no se pueden incluir en parafina inmediatamente después de transferirlas al alcohol, se debe realizar esta operación.

Vibriosis

Nombre de la enfermedad/enferme- dades

Agentes etiológicos

Rango geográfico y especies afectadas

Rango geográfico

Diagnóstico de la vibriosis .1 Diagnóstico presuntivo

Diagnóstico histológico (ver Sección 4.2.)
Diagnóstico confirmatorio

Obtención de muestras para diagnós- tico microbiológico en el Laboratorio de

Juveniles
Animales lo suficientemente grandes para extraer hemolinfa

vibriosis; En algunas regiones de América Latina, la vibriosis también se conoce como síndrome de la gaviota. ¾ Los camarones moribundos parecen hipóxicos y a menudo se mueven hacia la superficie y los bordes de los estanques. ¾ Podrás observar aves marinas alimentándose de camarones que se acercan a la superficie.

¾ Altas concentraciones de bacterias en la hemolinfa (según observaciones de preparaciones húmedas, frotis de hemolinfa o examen húmedo directo de larvas o postlarvas con objetivos de 40, 60 o 100x). ¾ Utilizando instrumentos de disección esterilizados a la llama, retire la cutícula de uno de los segmentos abdominales o del cefalotórax. Coloque una gota de hemolinfa sobre la placa de agar y extiéndala con el asa de platino.

Diagnóstico histopatológico

Técnicas para el diagnóstico histológico

Técnicas preferidas actualmente

Muestreo, fijación y tinción
Lesiones histológicas ocasionadas por la vibriosis

Vibriosis de larvas y postlarvas

¾ En la colonización cuticular de las regiones de la boca y del estómago, es común observar el redondeo y desprendimiento de las células epiteliales que revisten el interior de los túbulos del hepatopáncreas (fenómeno conocido como “bolas blancas”) (ver figuras adjuntas). ¾ Generalmente, a la colonización cuticular le sigue la invasión del hepatopáncreas y del intestino y finalmente infecciones sistémicas en la fase terminal de la enfermedad. ¾ El síndrome de hepatopancreatitis séptica (SHPS) es una enfermedad bastante importante de P.

La escarlatina también es una expresión clínica de la infección por el virus del síndrome de la mancha blanca (ver sección 3.1). ¾ Algunos informes vinculan el síndrome de hepatopancreatitis séptica (SHPS) con el consumo de alimentos con rayas o hongos. ¾ El principal tipo de lesión observada por histología es la atrofia generalizada del hepatopáncreas, acompañada de necrosis multifocal e inflamación hemocítica de los túbulos, que se propaga desde la región apical a la región proximal a medida que se desarrolla el síndrome.

V IBRIOSIS

Hepatopancreatitis necrotizante (“Necroti- zing Hepatopancreatitis”; NHP)

Nombre de la enfermedad y agente etiológico

Agente
Métodos de diagnóstico preferidos actualmente

Rango geográfico y especies afectadas

Rango geográfico

Síntomas externos de NHP
Factores ambientales

Procedimientos para el diagnóstico

Preparaciones de hepatopáncreas en húmedo
Histopatología
Uso de sondas genéticas para la detección de NHP

La bacteria que causa NHP es una bacteria pequeña, gramnegativa y altamente pleomórfica, y parece ser un parásito intracelular obligado que infecta las células epiteliales de los conductos hepatopancreáticos. ¾ Hibridación in situ o dot-blot con sondas genéticas específicas para la detección de NHP (disponible en DiagXotics, Inc.). Hasta la fecha, las infecciones por NHP sólo se han informado en camarones peneidos americanos.

Características ambientales muy similares precedieron a las epizootias de NHP en Venezuela, Brasil, Ecuador, Costa Rica y Panamá en 1995. En la Universidad Texas A&M se desarrolló una sonda genética no radioactiva marcada con DIG, específica para la detección de NHP. Como resultado, todavía no es posible encontrar en el mercado métodos rápidos de "transferencia puntual" para la detección del agente causante del NHP.

Referencias generales importantes
Métodos .1 Histología

Sondas genéticas
Hibridación in situ
PCR y RT-PCR

Enfermedades virales .1 IHHNV

WSSV

Enfermedades bacterianas .1 Vibriosis

Partial characterization and cloning of the genome of PvSNPV (=BP-type virus) pathogenic to Penaeus vannamei. Use of gene probes as diagnostic tools for White Spot Baculovirus (WSBV) of penaeid shrimp. Use of polymerase chain reaction for detection of infectious hypodermal and hematopoietic necrosis virus in penaeid shrimp.

A nondestructive method based on polymerase chain reaction for the detection of hepatopancreatic parvovirus (HPV) from penaeid shrimp. Development and application of monoclonal antibodies for the detection of white spot syndrome virus in shrimp. Distribution of yellowhead virus in selected tissues and organs of Penaeid shrimp Penaeus vannamei.

N OTAS