El objetivo de este trabajo fue la expresión de dos secuencias diferentes de la proteína GP5 del PRRSV en dos modelos, Escherichia coli y Pichia pastoris, a las que se les añadió una cisteína reactiva para conjugarlas con adyuvantes de partículas. Análisis del marco de lectura abierto de la glicoproteína GP5 del Virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino.
ÍNDICE DE CUADROS
ÍNDICE DE FIGURAS
Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino
La enfermedad Síndrome Reproductivo y Respiratorio Porcino (PRRS) ha afectado a los cerdos en los Estados Unidos de América (EE.UU.) desde 1987 y en Europa desde 1990; Desde entonces, la enfermedad se ha extendido rápidamente en la mayoría de los países productores de carne de cerdo del mundo (Bautista et al., 1993; Mardassi et al., 1994), y actualmente es endémica en muchos países (Dea et al., 2000). Como resultado, la enfermedad ha sido registrada en la lista de enfermedades de declaración obligatoria de la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE), Capítulo 1.2, Artículo 1.2.3 (OIE, 2012; Arias et al., 2003).
Virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino .1 Etiología del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino
- Organización del genoma y proteínas del VSRRP
La nucleocápside contiene una molécula de ARN monocatenario de polaridad positiva de aproximadamente 15 kb de tamaño (Dea et al., 2000). La respuesta inmune durante la infección viral induce la producción de anticuerpos neutralizantes (NA) y neutralizantes (ANN), donde la respuesta humoral mediada por células T se dirige contra GP2a, GP3, GP4, GP5, M y N (Bautista et al. 1999, Kimman et al., 2009).
La glicoproteína 5 como modelo antigénico .1 Topología de GP5
- La naturaleza neutralizante de GP5
- GP5 como candidata a subunidad recombinante .1 Alternativas para vacunas de nueva generación
- Los avances en el estudio de GP5
La capacidad de la proteína GP5 del PRRSV para inducir la producción de anticuerpos neutralizantes reside en epítopos que pueden ser reconocidos en el ectodominio de la proteína (Ostrowski et al., 2002; Mateu y Díaz., 2007). 16 son sistemas de expresión ampliamente utilizados en el desarrollo de vacunas (Jinshun et al., 2010), Jiang et al.
Plataforma de presentación de antígenos
- Partículas virales como adyuvantes proteicos
- Estrategias para la presentación de antígenos
- Conjugación química antígeno-adyuvante
Algunos trabajos tienen como objetivo mejorar el procesamiento y la presentación de la proteína GP5 en la célula. Con la excepción de la proteína verde fluorescente (Kratz et al., 1999), las secuencias generalmente no deberían hacerlo.
Sistemas de expresión de proteínas recombinantes .1 Selección de un sistema de expresión
- Sistema procariótico: Escherichia coli
- Expresión basada en promotores transcripcionales
- Formas de expresión de proteínas heterólogas
- Sistema eucariótico: Pichia pastoris
- Regulación molecular en la expresión génica del ADNr
- Promotor inducible: P AOX1
Las técnicas de ingeniería genética y la elección de un sistema de expresión determinan principalmente las características de la proteína a sintetizar (Aliahmadi et al., 2006). En términos generales, los vectores de expresión contienen: el gen que codifica la proteína de interés, el origen de replicación, un marcador seleccionable que confiere resistencia a un antibiótico, un promotor que regula la transcripción del gen exógeno y un terminador. transcripción (Córdoba et al., 2003). Algunos vectores generan la proteína recombinante en forma de proteínas de fusión o unidas a péptidos (His6, GST y Trx) de características conocidas, que proporcionan una etiqueta de reconocimiento, lo que simplifica el proceso de purificación y replegamiento de la proteína desnaturalizada mediante cromatografía de afinidad (Hanning y Makrides, 1998).
26 periplasma facilita el plegamiento de proteínas y la formación de puentes disulfuro (Depuydt et al., 2009). Otra cuestión a considerar es que la proteína final puede representar una metionina formilada en el extremo N (Carrio y Villaverde, 2001; Singh y Panda, 2005). Para que la proteína recombinante sea secretada al medio, se requiere la presencia de una secuencia señal en la proteína exógena que indique la vía de secreción.
La presencia de la proteína madura se verificó mediante el reconocimiento de anticuerpos de la etiqueta de histidina, presente en el extremo carboxilo terminal de la proteína madura.
MATERIALES .1 Microorganismos
En términos generales, se modificaron dos secuencias del gen gp5 del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino con una etiqueta que contiene una cisteína con fines de conjugación química y se diseñaron estrategias de clonación en vectores E. Vector de expresión que contiene una tiorredoxina como proteína de fusión (Thioredoxin His-Patch), un sitio de clonación direccional TOPO® mediado por una topoisomerasa. Contiene el gen lacI que codifica el represor lac que reduce la transcripción basal del promotor T7lac en el vector y el promotor lacUV5 en el cromosoma BL21(DE3); un gen de resistencia a ampicilina como marcador de selección; y un origen de replicación pBR322 para un número de copias bajo.
Se utilizaron los siguientes reactivos, los cuales se clasifican en las Tablas 10 según el tipo de uso en el laboratorio. QIAGEN Kit de extracción en gel MinElute para purificación de ADN QIAquick PCR QIAGEN Purificación de fragmentos Kit de purificación de ADN Kit de plásmido Midiprep Extracción de ADN plasmídico a.
MÉTODOS
- Diseño de los genes modificados de GP5 de VSRRP
- Ectodominio de GP5: análisis in silico y diseño de los genes modificados
- Sistema eucariótico: Pichia pastoris
- Clonación del ectodominio GP5 en el vector de pPICZα B
- Clonación del gen gp5 ResPRRS_MLV modificado en pPICZα B y pGAPZαB
- Transformación de la levadura Pichia pastoris
Para el diseño de los genes, la parte expuesta de la proteína se consideró el ectodominio de GP5. La estrategia para la construcción de los plásmidos consistió en marcar la región del ectodominio GP5 con una secuencia que contiene una cisteína que permite su conjugación química a adyuvantes de partículas. La estrategia en el diseño de los plásmidos consistió en marcar el gen gp5 truncado con una cisteína que también permite su conjugación química a un adyuvante de partículas.
La secuencia de la etiqueta de cisteína (GGCGG) se integró en el cebador en dirección 5' o 3'. Los genes del ectodominio GP5 en el vector pUC57 se movilizaron en el vector pPICZα B para P. 40. Las bandas en el gel correspondientes al peso molecular deseado se cortaron físicamente con una navaja y se purificaron con el kit de extracción en gel MinElute de QIAGEN.
El análisis de colonias de Pichia pastoris transformadas consistió en determinar la inserción del gen GP5 en el genoma de la levadura y comprobar la capacidad de la colonia para crecer y metabolizar metanol como inductor en el caso del promotor PAOX1 (pPICZα B).
2.2.5.1 Análisis del genotipo por PCR
Por lo tanto, los procedimientos utilizados para los análisis de expresión de proteínas en la página 45 se describen a continuación. El ADN genómico (ADNg) de las colonias transformantes se extrajo utilizando el protocolo del kit de purificación de ADN de levadura EPICENTER MasterPureTM.
2.2.5.2 Análisis del fenotipo AOX1
- Expresión de la proteína bajo dos promotores: P AOX1 y P GAP
El producto de la amplificación se observó mediante electroforesis en gel de agarosa y se consideraron como controles el pDNA del vector pPICZαB vacío y la cepa X-33 no transformada. Para ello se determinó el fenotipo AOX1 de las colonias que resultaron positivas en el análisis de genotipo, en los cuatro constructos GP5 así como en el vector pPICZαB vacío, con base en el manual del kit EasySelect Pichia Expression y se utilizó la cepa X como positiva. control -33 Mut+ fenotipo. Los clones se sembraron en paralelo en medio sólido con glucosa (MDH) y metanol (MMH) durante 48 horas a 30°C.
La inducción de la expresión de proteínas con el ectodominio GP5 modificado en Pichia pastoris bajo un promotor inducible, PAOX1, en presencia de metanol, se realizó con base en el kit manual EasySelect Pichia Expression para el fenotipo Mut+. El diseño experimental se basó en el uso de unos pocos clones de fenotipo Mut+ para cada uno de los genes y el vector pPICZαB vacío y la levadura X-33 no transformada como controles negativos. Las inducciones se realizaron tanto en medio rico (BMMY) como en medio mínimo (MMY) para determinar el momento óptimo para la expresión de proteínas; Al mismo tiempo, se realizó el análisis de la transcripción mediante RT-PCR.
La inducción de la expresión proteica del gen gp5 modificado ResPRRS_MLV bajo un promotor constitutivo, PGAP, se realizó con base en los vectores de expresión Pichia para la expresión constitutiva y purificación de proteínas recombinantes, manualmente de Invitrogen.
2.2.6.1 Cinética de expresión para un medio constitutivo
2.2.6.2 Cinética de expresión para un medio inductor
47 - Al mismo tiempo, se midió la DO600 en un espectrofotómetro de luz visible utilizando células. La fracción celular se lisó mediante un método físico con perlas de vidrio de 0,5 mm (30 segundos/vórtice, 30 segundos/hielo, durante 10 ciclos). 48 - En el caso de la cinética en medio mínimo, se midió la concentración de proteínas totales.
2.2.6.3 Análisis de la expresión génica
- Análisis de la expresión de la proteína madura
- Sistema procariótico: Escherichia coli
- Amplificación con Pfu de las secuencias RespPRRSV_MLV
- Expresión en células BL21(DE3) bajo un sistema pET
- Análisis de la expresión de la proteína madura GP5
El análisis de la cantidad de proteína total presente en la fracción del medio extracelular durante la inducción con metanol, en condiciones nutricionales mínimas, en diferentes tiempos, se realizó mediante el método de Bradford. Se analizó la presencia de la proteína madura secretada al medio extracelular durante la inducción con metanol o en medio constitutivo, así como la expresada. Luego se determinó su presencia mediante la técnica de transferencia Western utilizando un anticuerpo monoclonal que reconoce como cebador la etiqueta de seis histidinas presente en el extremo carboxilo terminal de la proteína recombinante.
La detección de proteínas maduras por transferencia Western tanto del ectodominio GP5 como de la proteína GP5 ResPRRS_MLV truncada se realizó mediante reconocimiento primario con un anticuerpo monoclonal anti-His6 y un segundo anticuerpo anti-IgG acoplado a peroxidasa. Antes de clonar los genes gp5 de la secuencia ResPPRS_MLV en vectores para E. Después de clonar la secuencia GP5 en el vector pET102/D-TOPO, primero se transformó en E.
Las 52 reacciones de PCR de punto final se describen a continuación; De manera similar, el producto de la amplificación se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa.
2.3.4 .1 Localización celular de la proteína madura GP5
- Purificación mediante cromatografía de afinidad
- Secuencias del gen gp5 modificadas para conjugación química
- Clonación de la región del ectodominio de GP5 modificado con cisteína
- Clonación del gen gp5 de ResPRRS_MLV en dos modelos de expresión
- Líneas transformantes con el gen gp5 modificado del VSRRP
- Transformación del gen gp5 de ResPRRS_MLV en el promotor P GAP
- Transformación del ectodominio GP5 del aislado viral en el promotor P AOX1
- Expresión en Pichia pastoris bajo dos promotores
- Expresión en Escherichia coli de GP5 modificada de la cepa vacunal
La detección de la proteína se realizó con anticuerpos mediante la técnica de Western blot, descrita en el apartado VI.2.2.7. Mientras que con el promotor del gen gap, la proteína GP5 (sin péptido señal) de la cepa vacunal ResPRRS_MLV se expresó constitutivamente. Análisis de la expresión génica mediante RT-PCR durante la cinética de expresión de la proteína recombinante.
Como alternativa a la expresión del ectodominio GP5 modificado, se expresó la proteína GP5 de la cepa vacunal ResPRRS_MLV, a la que se le había añadido una cisteína para su conjugación química en P. Esto demuestra que las condiciones de inducción permitieron la expresión de la proteína GP5 clonada en pET102. /D-TOPO en la cepa BL21(DE3). Cinética de expresión de la proteína GP5 madura ResPRRS_MLV mediante Western blot en E. coli.
Por el contrario, se expresó la proteína GP5 de la cepa vacunal (ResPRRS_MLV), modificada con cisteínas para conjugación química en E. La proteína se obtuvo en cuerpos de inclusión como resultado de la fusión con tiorredoxina en el extremo N de la proteína. Expresión del ectodominio de la proteína GP5 del virus del síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRSV) en E.
Memoria en Extenso
- Carta de aceptación 3.2 Memoria en extenso
- Reconocimiento
Memoria en Extenso
- Reconocimiento