NprRB EN Bacillus thuringiensis - Repositorio CIAD

14 Efecto sobre la actividad proteasa de la adición de diferentes péptidos sintéticos a las cepas mutantes Bt8741 (WT) de tipo salvaje. Los fenotipos de esporulación, actividad de proteasa neutra, enjambre, formación de biopelículas y expresión de la proteína CryIAa se vieron afectados por la mutación.

INTRODUCCIÓN

Lo anterior es una indicación de que la longitud y secuencia del péptido señal maduro (NprRB) influye en la función del sistema NprR-NprRB (Rocha et al., 2011). De manera similar, en el caso de la proteína PrgX participan dos péptidos señal, donde el péptido señal cCF10 (LVTLVFV) es un activador y el péptido iCF10 (AITLIFI) es un represor, los cuales están codificados en diferentes genes y se aplican a un individuo (bacteriano). celular) trabajo. diferente de quien lo produjo (Kozlowicz et al., 2006).

ANTECEDENTES

Proteínas Cry

Este último es necesario para la expresión a partir del promotor BtI de los genes que codifican las proteínas Cry dependientes de la esporulación, como los genes cryIAa, cryIIA y cryIB. El cristal parasporal se encuentra dentro del esporangio y normalmente fuera del exosporio de la espora.

Esporulación

Los más importantes son los 3 primeros ya que participan en el inicio de la esporulación (Kobayashi et al., 1995). Durante la fase de transición, Abr reorganiza la expresión de más de 100 genes de la fase postexponencial que tienen diversas funciones biológicas, incluida la formación de biopelículas, la motilidad, etc. (Strauch et al., 1990).

Mecanismo de Acción de Quorum Sensing

Familia de Receptores RNPP

Estos Raps actúan desfosforilando el regulador de respuesta Spo0F, impidiendo así el inicio de la esporulación. Se sabe que PrgX participa en la regulación de la expresión de genes implicados en la conjugación (Kozlowicz et al., 2006). El péptido señal PlcR se deriva de la proteína PapR, cuyo gen se encuentra inmediatamente aguas abajo de PlcR.

NprR es un regulador transcripcional cuya actividad depende de la unión de su péptido señal NprRB (también llamado NprX); el gen que codifica NprRB se encuentra junto a NprR, formando el casete NprR-NprRB (Perchat et al., 2011). Luego se procesa extracelularmente hasta su forma madura, presumiblemente hasta convertirse en un heptapéptido (SKPDIVG) o un octapéptido (SSKPDIVG); las cuales son secuencias de la región interna del péptido señal inmaduro que se exporta (Perchat et al., 2011, Cabrera et al.; datos no publicados).

General

La deleción de los genes nprR-nprRB de Bacillus thuringiensis afecta, además de a la esporulación y a la expresión de la proteasa NprA, a otros fenotipos relacionados con el quorum sensing.

Particulares

Evaluar la participación del gen nprRB y el dominio de unión al ADN de la proteína NprR en los fenotipos alterados. Para el desarrollo de este proyecto se utilizaron las cepas Bt 8741 (Bacillus thuringiensis serovar thuringiensis) y una cepa mutante derivada de Bt 8741 denominada ∆nprR-nprRB.

Complementación Genética de la Mutante

Esta cepa contiene el intercambio alélico spcR:nprR-nprRB y fue construida previamente en nuestro grupo de trabajo (Tabla 1). Las cepas transformadas se seleccionaron en función de su resistencia al antibiótico eritromicina, que confiere el plásmido pMAD, seleccionando las colonias que habían crecido y luego realizando PCR buscando los fragmentos nprR-nprRB, nprR, nprRΔHTH – B y nprRΔHTH, correspondientes a cada cepa, complementada específicamente, para confirmar la complementación deseada.

Fusiones Transcripcionales cry1Aa’Z y spoIIA’Z en Cepa Silvestre y Mutante ∆nprR-nprRB Mutante ∆nprR-nprRB

Proteasa Neutra

Esporulación

Transcripcion de SpoIIA

Formación de biopelícula

Transcripción de cry1Aa

Una vez conocidos los fenotipos alterados en la cepa mutante, se utilizaron las cepas complementadas ΔnprR-nprRB[pNprR-NprRB], ΔnprRnprRB[pNprR], ΔnprR-nprRB[pNprRΔHRB] y [ΔrnTH-NprTH-Np] descritas anteriormente, para repetir los ensayos de esporulación y proteasa neutra para evaluar el efecto de la complementación genética del mutante en estos fenotipos. Las cepas ΔnprRnprRB[pNprR] y ΔnprR-nprRB[pNprRAHTH] se utilizaron para probar con los péptidos señal sintéticos codificados en la región exportada del péptido NprRB (Fig.-2. En el caso del ensayo de peptidasa neutra, la peptidasa neutra El ensayo se añadió a la superficie de la placa de agar con leche hasta una concentración final de 1 µM para cada péptido.

En el caso del casete nprR-nprRB, los cebadores utilizados amplifican una sección que comprende la mitad de la secuencia del marco de lectura abierto de nprR y el gen nprRB (900 pb). En el caso de las cepas ΔnprR-nprRB[pNprRΔHTH] y ΔnprR-nprRB[pNprRΔHTH-NprRB], el fragmento nprR mostró un tamaño menor, debido a la deleción del dominio de unión al ADN.

Proteasa neutra

Esporulación

Transcripción de SpoIIA

Esta podría ser una forma en la que intervino el sistema NprR-NprRB y, en ausencia de este sistema, la subpoblación que no inicia la esporulación es mayor, lo que ayuda a mantener un estado biestable en la población. Asimismo, Fujita et al (2005) mencionan que para que el operón SpoIIA se active se necesitan niveles muy altos de Spo0A, ya que tienen poca afinidad entre sí. Esto nos lleva a creer que el sistema NprR-NprRB interviene positivamente en el inicio de la esporulación, permitiendo que el flujo de fosfatos sea más eficiente, dando lugar a mayores niveles de Spo0A.

Esporulación

SpoIIA

Se observó que en la cepa mutante la capacidad de movimiento de enjambre se ve afectada negativamente, teniendo una colonia un diámetro de 1,8 cm, mientras que en la cepa salvaje se observan los bordes irregulares de la colonia, revelando el movimiento de enjambre. Se puede observar el diámetro de la colonia (2,9 cm), lo que sugiere que NprR podría intervenir de alguna manera en este fenómeno (Fig.-8). Dubois et al (2012) encontraron genes en el regulón NprR que codifican proteínas involucradas en la síntesis de un lipopéptido llamado Kurstakin, y demostraron que esto es necesario para la movilidad similar a un enjambre de Bt. El fenotipo 'nadador' no se ve afectado en la cepa mutante, ya que el crecimiento comenzó donde se colocó la gota y se movió a toda la placa, como sucedió en la cepa salvaje.

El mecanismo de regulación del movimiento de "nadar" no ha sido descrito en profundidad en el grupo Bacillus cereus, pero estudios con Bacillus subtillis indican el papel del operón swrA, que regula la expresión de genes flagelares y es importante en la regulación de ambos. "nadar" y "dar a luz", así como el papel del lipopéptido surfactina en la movilidad de las bacterias. Sin embargo, la regulación del fenómeno de la "nadación" parece menos compleja, ya que dentro del operón swrA existen genes swrAA y swrAB, el primero de los cuales es fundamental para controlar el número de flagelos en el medio líquido y flagelo. Montaje en contacto con superficies sólidas.

Cepas

Formación de biopelícula

Estos resultados sugieren que el sistema NprR-NprRB está implicado en la regulación o activación de este fenómeno, ya que la cepa mutante fue capaz de producir una biopelícula, pero de forma defectuosa. En 2012, se observó que NprR es necesario para la regulación de las proteínas implicadas en la síntesis del lipopéptido de Kurstakin y se demostró que es necesario para la formación de biopelículas en Bt. Por tanto, el efecto observado puede deberse a que el sistema NprR-NprRB interviene en la regulación de la expresión de los genes que codifican estas proteínas.

Trabajos recientes muestran que sinR es esencial para la formación de biopelículas, actuando como represor de genes esenciales en este fenómeno. En consecuencia, NprR causaría indirectamente niveles bajos de sinI, haciendo que la regulación de la formación de biopelículas sea menos eficiente (Fujita et al. 2005).

Expresión de cry1Aa

Se sabe que este fenómeno está regulado por mecanismos de quorum sensing, como se reporta para P. Otro mecanismo en el que puede intervenir NprR y por el cual se afecta la capacidad de formación de biopelículas es a través del regulador Spo0A, ya que se afecta "fosforella". , los niveles de Spo0A fosforilada disminuirían afectando la capacidad activadora de sinI, que está regulada por Spo0A, sinI es el antirepresor de sinR.

Cry1Aa

En la Fig.-12 se observó que el casete nprR-nprRB completo fue capaz de complementar al mutante (ΔnprR-nprRB[pNprR-NprRB] veces), y recuperó el fenotipo neutro de producción de proteasa, observándose un halo de actividad idéntico al de cepa Bt8741. Por otro lado, el gen del receptor nprR por sí solo no pudo complementar al mutante, lo que sugiere que se requiere el péptido señal para que funcione como un regulador transcripcional de proteasa neutra. Esto se confirmó porque en la cepa mutante transformada con el casete nprR-nprRB completo pero con un gen nprR que carecía del dominio HTH, no se restauró la actividad proteasa neutra.

En las cepas ΔnprR-nprRB[pNprR-NprRB] y ΔnprR-nprRB[pNprRΔHTH-NprRB], se restauró el fenotipo de esporulación de tipo salvaje; Es interesante observar que el sitio de unión al ADN de la proteína NprR no era necesario para su función. de la esporulación, lo que sugiere que el sistema NprR-NprRB actúa como regulador de la esporulación a través de un mecanismo independiente de su función reguladora transcripcional. La Figura 14 muestra el efecto de agregar péptidos sintéticos a placas que contienen cepas mutantes ΔnprR-nprRB de tipo salvaje (WT) y cepa ΔnprRnprRB[pNprR], donde se encontró que el heptapéptido SKPDIVG y el octapéptido SSKPDIVG podían restaurar la actividad de la proteasa neutra, mientras que el los péptidos restantes no lo hacen.

CONCLUSIONES

SKPDT is a signal peptide that stimulates sporulation and cry1Aa expression in Bacillus thuringiensis but not in Bacillus subtilis. Evidence that entry into sporulation in Bacillus subtilis is regulated by a gradual increase in the level and activity of the master regulator Spo0A. Contribution of surfactin and SwrA to flagellin expression, swimming and surface motility in Bacillus subtilis.

Analysis of the ssb (kinC) suppressor mutation sur0B20 (spo0A) in Bacillus subtilis reveals that kinC encodes a histidine protein kinase. A new family of aspartyl phosphate phosphatases targeting the Bacillus subtilis sporulation transcription factor Spo0A.