A nivel mundial, las garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus representan un grave problema de salud para el ganado, especialmente en las regiones tropicales y subtropicales. Las garrapatas Rhipicephalus (Boophilus) microplus son un grave problema de salud para el ganado en todo el mundo, especialmente en las regiones tropicales y subtropicales.
Anexo 3. Análisis in silico de la proteína de garrapata de 2- intestino insoluble
Anexo 4. Análisis in silico de la proteína de garrapata de 1- ovario insoluble
Anexo 5. Análisis in silico de la proteína de garrapata de 2- ovario insoluble
Anexo 7. Análisis in silico de la proteína de garrapata de 4- ovario insoluble
Por otro lado, anualmente se destinan más de 2 millones de dólares para el control de las garrapatas en todo el mundo (Guerrero, Nene et al., 2006). La vacuna comercial Gavac® (Cuba) se ha utilizado con éxito para controlar la garrapata R.
Importancia de las garrapatas
Importancia económica
Todas las etapas de la fase parasitaria se llevan a cabo en el mismo animal, por lo que se le llama garrapata de un solo huésped para distinguirla de otras garrapatas que necesitan 2 o 3 huéspedes para completar su vida parasitaria, como ocurre con otras especies, como como A. Después del apareamiento, las hembras fecundadas derraman de 0,3 a 0,5 ml de sangre del animal huésped, iniciando así el nuevo ciclo de puesta de huevos y muerte de la hembra (Figura 2).
Distribución geográfica
La fase libre (verde) representa una parte importante de la zona norte del país y una pequeña zona en el centro; Comprende 94,4 millones de hectáreas, correspondientes al 47,88% del territorio nacional. Las áreas de extinción suman 1,1 millones de hectáreas; En estas regiones el parásito ha sido eliminado gracias a la campaña y representan el 0,57% del territorio.
Control químico natural
17 distribución que abarca zonas tropicales, templadas y áridas, que en conjunto cubren km2, lo que constituye el 53,0% del territorio nacional. Finalmente, las áreas en Fase de Control alcanzan actualmente una superficie total de 101.6 millones de hectáreas y representan el 51.5% del país (www.senasica.gob.mx).
Hospederos resistentes
Depredadores naturales
La rotación, descanso y quema de praderas
Existen leguminosas con la capacidad de atrapar larvas, a través de los pelos y secreciones viscosas de las glándulas presentes en sus hojas y que tienen la capacidad de inmovilizar entre 12-27% de las larvas de R. En México, el efecto de las gramíneas forrajeras ha Se han evaluado: Melinis minutiflora y Andropogon gayanus, que tienen la capacidad de repeler, atrapar o disuadir a las garrapatas que buscan huéspedes y pueden reducir el riesgo de colisión entre garrapatas y ganado (Cruz-Vazquez y Fernández-Ruvalcaba 2000, Fernández-Ruvalcaba et al. , 2004).
Control biológico
La estrategia global más comúnmente utilizada es la aplicación de ixodicidas en el cuerpo de los animales infectados, con intervalos de tiempo determinados por la región ecológica, la especie a destruir y la efectividad restante del ixodicida (Rodríguez-Vivas et al., 2008). En línea con esta estrategia, el método de aplicación de acaricidas más utilizado es la aspersión con retroexcavadora (Benavides y Romero, 2001; Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología - Fondo Sectorial de Investigación en Agricultura, Ganadería, Acuicultura, Agrobiotecnología y Recursos Fitogenéticos [Conacyt-Sagarpa ], 2005; Baffi et al., 2007), que en la garrapata tienen el efecto común de alterar la transmisión del impulso nervioso en la unión sináptica a través de diferentes mecanismos de acción que afectan a los neurotransmisores o canales iónicos que los median. esto (Figura 4).
Mecanismos de resistencia a acaricidas en R. microplus
Control de infestaciones de garrapatas mediante vacunación
La vacunación se considera una alternativa ambientalmente segura y económicamente sostenible para el control de ectoparásitos. Las ventajas del uso de vacunas contra garrapatas, como parte de un programa de control integrado, incluyen una reducción en el uso de acaricidas, lo que extiende la vida útil de los acaricidas y retrasa la aparición de resistencia, lo que a su vez disminuye la incidencia de enfermedades transmitidas por R.
Antígenos expuestos y ocultos
Los anticuerpos anti-Bm86 aparentemente se unen a la superficie de las células epiteliales de la pared de la garrapata e interrumpen la endocitosis, provocando lisis celular y reduciendo la capacidad reproductiva de las hembras maduras (Willadsen 1997) (Figura 7). Se ha sugerido que el efecto de la vacuna Bm86 podría potenciarse mediante la inclusión de otros antígenos eficaces o mediante el uso de adyuvantes.
Identificación de nuevos antígenos
Los elementos del sistema inmunológico presentes en la sangre penetran a través del capítulo y la boca de la garrapata hasta llegar al intestino, donde reaccionan con las moléculas diana y provocan la inhibición de la función biológica de 1) los linfocitos; Importantes avances en inmunología molecular y biotecnología nos llevan a proponer la búsqueda de nuevos antígenos con potencial vacunal a partir de proteínas del intestino y ovarios de la garrapata R.
Objetivo general
Objetivos específicos
Muestreo de garrapatas en INIFAP Morelos (colección de tejidos, cepa Media Joya) PAGINA SDS de proteínas intestinales y.
Garrapatas
Disección de tejidos y extracción de proteínas
Las muestras de proteínas se cuantificaron utilizando el ensayo de proteínas DC (Bio-Rad, EE. UU.) (Lowry et al., 1951).
Electroforesis unidimensional
Se diluyeron 39 muestras moleculares (Precision Plus Protein Standards, Bio-Rad) 1:19 en tampón de muestra SDS-PAGE y se calentaron a 100 °C durante 5 minutos. Los geles se procesaron en tampón de electroforesis (glicina 192 mM, Tris 25 mM, SDS al 0,1%) durante 80 minutos a 120 V, se tiñeron con azul de Coomassie y se visualizaron y fotografiaron con un sistema de documentación Gel-Doc. XR (Bio-Rad).
Bovinos
La emulsión se preparó con el lisado de proteínas intestinal y ovárica de las fracciones soluble e insoluble, en PBS más adyuvante Montanide ISA 50V (anhidromanitoleteroctodecenoato en aceite mineral) (Seppic, París, Francia) en una relación de volumen de 1:1. Se preparó un lisado de proteína total larval según el método de Shahein et al., (2008). Se diluyó 1 µg de proteínas totales en 100 µl de tampón de carbonato de sodio (Na2CO3 50 mM) y se usó para recubrir cada pocillo de una microplaca de 96 pocillos; Luego se incubó durante la noche a 4ºC.
Electroforesis bidimensional
Ensayos de Western blot
Análisis de LC-MS/MS
Después de eliminar el acetonitrilo, los trozos de gel se secaron en un concentrador Speed-Vac durante 20-30 min. El análisis LC-MS/MS se realizó en un espectrómetro de masas de tiempo de vuelo cuádruple híbrido Waters Q-Tof Ultima con una fuente de nanoelectropulverización. La cromatografía se realizó en una HPLC Packings LC con una columna PepMap C18 usando un gradiente lineal de acetonitrilo con un caudal de 200 nl/min.
Síntesis de cDNA
El ADNc se sintetizó a partir de 5 μg de ARN, con el sistema de síntesis de primera cadena Superscript® III (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Análisis bioinformático
Cuantificación de las proteínas
Detección de proteínas inmunogénicas por R. A) Las proteínas intestinales solubles se sometieron a electroforesis SDS-PAGE bidimensional (12%, pH 3 a 10) y se tiñeron con azul de Coomassie. Detección de proteínas inmunogénicas R. A) Las proteínas intestinales insolubles se sometieron a electroforesis SDS-PAGE bidimensional (12%, pH 3 a 10) y se tiñeron con azul de Coomassie. Detección de proteínas inmunogénicas R. A) Las proteínas ováricas insolubles se sometieron a electroforesis SDS-PAGE bidimensional (12%, pH 3 a 10) y se tiñeron con azul de Coomassie.
Evidencia de múltiples vitelogeninas en R. microplus
Las reacciones de RT-PCR se realizaron utilizando ARN total de ovarios de garrapatas hembras adultas lesionadas.
DISCUSIÓN
Vitelogeninas en garrapatas
En la fase previa a la oviposición (pareja y completa), se encontró una alta expresión de vitelogenina en el cuerpo graso e intestino, y una baja expresión en el ovario de las hembras. El análisis de transferencia Northern mostró que la vitelogenina 2 se expresa en la grasa corporal y el intestino de las hembras vitelogénicas, pero no en el ovario. La vitelogenina-2 se expresó en el ovario y el cuerpo graso, mientras que la vitelogenina-3 solo se expresó en el cuerpo graso.
CONCLUSION
PERSPECTIVAS
En la Tabla 9 se muestran los diferentes software que se utilizaron para realizar el análisis de las regiones inmunogénicas de las proteínas, que dieron como resultado los péptidos más inmunogénicos.
Field studies and cost-effectiveness analysis of vaccination with Gavac (TM) against the cattle tick Boophilus microplus. Detection of esterase activity in susceptible and organophosphate-resistant strains of the cattle tick Boophilus microplus. Proteome analysis of abundantly expressed proteins from unfed larvae of the cattle tick, Boophilus microplus.
APENDICE
Electroforesis de Proteínas SDS-PAGE 1D
- Isoelectroenfoque
- Protocolo de corrida del isoelectroenfoque
- Soluciones
- Amortiguador de Transferencia Trizma-base 25 mM
Tome la tira de IPG y colóquela en gel en uno de los canales de la bandeja del colector, comenzando por el canal número uno. Coloque un parche de electrodo, previamente rehidratado con 150 µL de agua bidestilada, a cada lado de la tira. Ensamble los componentes dentro de la prensa del equipo de electrotransferencia en el siguiente orden: 1) esponja 2) papel 3) gel 4) membrana 5) papel 6) esponja.
ANEXOS
Proteína 1-Int-Sol
Además, la Figura 1 muestra una imagen representativa del andamio utilizado para el análisis de las proteínas (1-Int-Insol, 2-Int-Insol, 1-Ova-Soluble, 2-Ova-Soluble, 3-Ova-Soluble, 4a-Ova-Soluble, 4b-Ova-Soluble, 1-Ova-Insoluble, 2-Ova-Insoluble, 3-Ova-Insoluble y 4-Ova-Insoluble), proporcionado por la Universidad de California. Imagen representativa del programa de andamiaje, que muestra el gi, la probabilidad de la posible proteína (nombre y organismo al que pertenece) y los aa encontrados para la proteína. A continuación, la secuencia de la proteína se ingresó en el programa de libre acceso ExPASy: SIB Bioinformatics Resource Portal-Home, que proporciona el peso molecular y el punto isoeléctrico, figura 2.
Proteína 2-Int-Insol Rhipicephalus pulchellus
Luego, la secuencia de proteínas se ingresó en el programa de libre acceso ExPASy: SIB Bioinformatics Resource Portal-Home, que nos proporcionó tanto el peso molecular como el punto isoeléctrico, Figura 4.
Proteína 1-Ova-Insol
Posteriormente, la secuencia de la proteína fue ingresada al programa de acceso gratuito ExPASy: SIB Bioinformatics Resource Portal-Home, el cual nos proporcionó su peso molecular así como su punto isoeléctrico, Figura 6.
A continuación, la secuencia de la proteína fue ingresada al programa de acceso gratuito ExPASy: SIB Bioinformatics Resource Portal-Home, el cual nos proporcionó su peso molecular así como su punto isoeléctrico, figura 8.
Posteriormente, la secuencia de la proteína fue ingresada al programa de acceso gratuito ExPASy: SIB Bioinformatics Resource Portal-Home, el cual nos proporcionó su peso molecular así como su punto isoeléctrico, Figura 10.
Luego, la secuencia de proteínas se ingresó en el programa de libre acceso ExPASy: SIB Bioinformatics Resource Portal-Home, que nos proporcionó tanto el peso molecular como el punto isoeléctrico, Figura 12.
Anexo 8. Proteínas de ovario solubles (tabla 3)
Protein samples were quantified with the DC protein assay (Bio-Rad, USA) (Lowry et al., 1951). 1D and 2D immunoblots were performed according to the protocol developed by Towbin et al. (Towbin et al., 1979). In the oocytes, Vitellogenin subunits are recombined and converted into Vitelline, the egg storage protein (Thompson et al., 2007).
