La aplicación de bacteriocinas logró una disminución significativa en la aplicación de conservantes químicos y tratamientos físicos como enfriamiento y calentamiento drástico (Gahnbari et al., 2013). A pesar de la larga historia del uso de bacteriocinas, existen pocos informes de resistencia bacteriana. La clasificación de las bacteriocinas generalmente se ha determinado según sus propiedades químicas, físicas y genéticas, así como su espectro de actividad (Vásquez et al., 2009; Mondragón 2013).
Clase I lantibióticos
La clase IV está formada por un grupo heterogéneo de proteínas que contienen adiciones de carbohidratos y lípidos (Vásquez et al., 2009; Mondragón 2013). La clasificación presentada anteriormente se ha ampliado en especificaciones de características después de una evaluación constante durante los últimos años. La gran mayoría de autores han optado por aplicar esta clasificación por considerarla la más adecuada en base a los resultados de extensas investigaciones recientes (Pérez et al., 2014). Péptidos pequeños (<10 kDa), lineales y sin modificaciones postraduccionales, termoestables y con estructura anfipática helicoidal que les permite actuar a nivel de la membrana plasmática y provocar la muerte de la célula sensible (Deegan et al., 2006 ).
Son péptidos activos que contienen la secuencia consenso en la región N-terminal YGNGVXC (Tyr-Gly-Asn-Gly-Val-Xaa-Cys), responsable de la alta potencia contra patógenos presentes en alimentos como Listeria monocytogenes. Además, está estabilizado por dos cisteínas que forman un puente disulfuro, y la parte C-terminal hidrofóbica y/o anfifílica que consta de una o dos hélices α (Castillo et al., 2013). Los miembros de este grupo son lactococina G, plantaricinas EF y JK, lactacina F (Oppegard et al., 2010; Zacharof et al., 2012).
Clase III
Esta clasificación está reservada para aquellas bacteriocinas que requieren residuos no proteicos para su actividad, pero todavía no hay miembros de esta clase demostrados de manera convincente, por lo que no incluyeron esta clase en la nueva propuesta (Cotter et al., 2005; Rea et al. . al., 2005; Rea et al., 2011). Es necesario estudiar en profundidad el tipo de antimicrobiano, el tipo de alimento, las condiciones de almacenamiento, los tipos de procesos que se aplican al alimento y con mucha importancia se debe determinar el tipo de microorganismo que se quiere atacar (Davidson et otros, 2013). La criopreservación se utiliza comúnmente como técnica de conservación de bacterias (Kanmani et al., 2011). Este método físico-químico permite la preservación de microorganismos estables, que pueden no sufrir cambios genotípicos por un tiempo (Sánchez et al., 2005).
Sin embargo, este método trae consigo efectos no deseados tanto para las membranas bacterianas como para su metabolismo (Kanmani et al., 2011). Defectos indeseables surgen porque el agua se incluye como microambiente en este proceso y es la que cambia su estado de líquido a sólido; Por otro lado, las bacterias inmersas en este ambiente deben adaptarse a las condiciones de este nuevo entorno, transformar su tasa metabólica, mantener su estabilidad y evitar que los cristales de hielo formados por el cambio de temperatura del agua causen algún daño (Sánchez et. al. ., 2005). Aunque la capacidad de los microorganismos para transformar las propiedades físicas, químicas y biológicas del ambiente en el que se encuentran en cualquier condición se enfatiza aún más en condiciones desfavorables en las que se ven obligados a provocar cambios significativos y rápidos en sus actividades metabólicas. (Sánchez et al., 2005).
Aunque la respuesta bacteriana al estrés por frío aún no se ha caracterizado en detalle, se sabe que está directamente relacionada con la composición de la membrana, la fase de crecimiento y el metabolismo respiratorio de cada célula. Los sistemas reguladores que controlan las respuestas al estrés en Saccharomyces cerevisiae producen efectos a nivel transcripcional (Randez-Gil et al., 2002).
Cepas y Condiciones de Cultivo
Evaluación de Actividad Antimicrobiana célula-célula
25 tripticasa (0,4%) con 1 ml a una concentración de 1x10-2 UFC/mL Salmonella Saintpaul (aprox. 0,07 log UFC/ml), dicha mezcla se utilizó como recubrimiento sobre los aislados de 24 horas. Los aislados que mostraron actividad antimicrobiana contra la cepa indicadora fueron seleccionados para la evaluación de los mecanismos antimicrobianos.
Obtención de Extractos Crudos
Concentración de Extractos Crudos por Liofilizado
Una vez transcurrido el tiempo de incubación, se examinaron las placas en busca de zonas claras que indicaran inhibición alrededor de cada colonia, lo que podría indicar producción de bacteriocinas. En el momento de la resuspensión, los extractos se esterilizaron a través de filtros de poro de 0,22 µm (Delgado et al., 2001). Para determinar el mecanismo por el cual las bacterias ejercen su efecto antagonista, se tomaron los extractos y se ajustó el pH a 7 para la neutralización de los ácidos orgánicos. Posteriormente se añadió catalasa para eliminar el peróxido de hidrógeno (1 mg/ml) (Ogunbanwo et al., 2003).
El ensayo consistió en evaluar el extracto crudo sin modificaciones, el extracto a pH 7, el extracto con catalasa y el extracto a pH 7 con catalasa. La evaluación de los extractos se realizó mediante la técnica de placa de pozos de Mayr-Harting y colaboradores (1972), utilizando un inóculo de 1 ml a 1x10. La actividad se midió en milímetros de la zona de inhibición, excluyendo el diámetro del pozo.
Evaluación de Estabilidad Térmica
Evaluación del pH sobre la Estabilidad Proteica
Estabilidad ante Tratamiento Enzimático
Estabilidad ante Solventes Orgánicos, Sales Metálicas y Surfactantes
De este resultado, destaca el bajo porcentaje de aislados que mantuvieron actividad antagónica después de la criopreservación durante dos años, y aunque puede haber muchos factores que afectan a las bacterias criopreservadas, la razón más notable es un posible cambio genético en los aislados. el estrés causado por las bacterias durante la criopreservación conduce a cambios fenotípicos y genotípicos, en los que se ha suprimido la producción de metabolitos secundarios con actividad antimicrobiana (Sánchez et al., 2005). Uno de los grandes problemas que puede acarrear este estrés es la creación de cambios que pueden ser permanentes en su actividad enzimática y capacidad antagónica (Sánchez et al., 2005). Cada extracto crudo se secó mediante liofilización con el objetivo de mantener la actividad de la bacteriocina, ya que este método es uno de los mejores para conservar proteínas (Prestrelsky et al., 1993) y se ha demostrado que previene la pérdida de actividad o disminución de la estabilidad. de la bacteriocina (Moreira, 1993).
Otros autores han reportado producción de bacteriocina durante la fase exponencial tardía y una producción máxima durante su fase estacionaria, seguida de una disminución de la actividad durante las siguientes 16 horas (Liu et al., 2015). La disminución de la actividad antimicrobiana observada después de una incubación prolongada puede deberse a la degradación de las bacteriocinas por las enzimas proteolíticas presentes en el medio (Sivaramasamy et al., 2014). Se ha informado que las condiciones óptimas para el crecimiento bacteriano y la secreción de bacteriocina varían drásticamente entre bacterias del mismo género (Castillo-Martínez et al., 2013).
Por ejemplo, se ha demostrado que reducir el pH de 7,5 a 6,0 mejora la unión y la permeabilidad de la Pediocina PA-1 (Chen et al., 1997). Algunas bacteriocinas con una carga neta positiva tienen mayor facilidad para unirse a los grupos de cabeza de fosfato de los fosfolípidos cargados negativamente (Ishizaki et al., 2000).
Resistencia Térmica
Chen y colaboradores (1997) encontraron que la composición lipídica de la membrana diana es un factor determinante en la modulación de la acción de la pediocina PA-1, específicamente la afinidad de esta bacteriocina por las vesículas lipídicas aumenta con el aumento del contenido de lípidos. También se ha descubierto que la afinidad de unión de algunas bacteriocinas a las membranas diana está determinada por el pH. Por otro lado, la formación de poros por la bavaricina MN es óptima a pH 6,0 y menos eficiente a otros valores de pH (Kaiser y Montville, 1996).
Estabilidad a Distintos pH
Estabilidad Enzimática
39 actividad después de la exposición a las enzimas pepsina, papaína y proteinasa K (Avaiyarasi et al., 2016); Bacteriocina producida por Lactobacillus paracasei subsp. Es importante señalar que aún no se conoce el papel de las modificaciones postraduccionales y es probable que estas modificaciones proporcionen resistencia a enzimas endógenas, lo que podría aumentar su estabilidad (Cao et al., 2014). La estabilidad a las enzimas digestivas que presenta la bacteriocina A1 podría ser una limitación en el uso de este producto como biocontrol en la superficie de alimentos recién consumidos.
Sin embargo, existen muchas otras enzimas digestivas que se pueden evaluar en busca de una que sea capaz de inactivar esta bacteriocina. Aún con este resultado, la bacteriocina A1 continúa representando una posible alternativa para su aplicación en campo, en el control de bacterias fitopatógenas. Efecto de tratamientos enzimáticos sobre la actividad bacteriocinogénica del extracto A1 en Salmonella Saintpaul.
Estabilidad ante Surfactantes
Estabilidad ante Solventes
Esto indica una variación de la respuesta que depende de las bacterias a inhibir y de la naturaleza de cada bacteriocina (Sheikh et al., 2009). El mantenimiento de la actividad bacteriocinógena del extracto crudo producido por A1 (Figura 3) frente a los diversos metales pesados evaluados indica la estabilidad que puede presentar al exponerse a ellos debido a la contaminación por metales introducidos a través del suelo, agua y equipos durante la preparación del procesado. alimentos. Por otro lado, Avaiyarasi y colaboradores (2016) encontraron diferencias entre la inhibición de Salmonella enterica MTCC 3219 y Salmonella typhi MTCC 734 debido a la acción de la bacteriocina producida por Lactobacillus sakei GM3, lo que discrepa con nuestros resultados, donde no se muestran algunas diferencias. (P≤0,05). ) entre los diferentes serotipos de Salmonella de la bacteriocina producida por A1.
Lo que indica una ventaja de la bacteriocina A1, que tiene la capacidad de inhibir tanto las bacterias productoras de ETA como las fitopatógenas (Figura 4). El análisis de la secuencia de las bases del gen ribosómico 16D de A1 mostró una similitud del 99% con la de Lactobacillus graminis reportada en la base de datos de genes NCBI, donde hasta la fecha solo se ha reportado el genoma de Lactobacillus graminis DSM 20719 NODE_43. (NCBI, 2016). Cribado y caracterización de bacterias productoras de bacteriocinas capaces de inhibir el crecimiento de la mastitis bovina.
Purification of the bacteriocin bavaricin MN and characterization of its mode of action against Listeria monocytogenes Scott A cells and lipid vesicles. Antibacterial activity and optimization of bacteriocin-producing lactic acid bacteria isolated from beef (red meat) samples. Production, purification and characterization of bacteriocin from Lactobacillus murinus AU06 and its broad antibacterial spectrum.
Uso de sustancias antimicrobianas producidas por bacterias ácido lácticas en la conservación de carne.
