INTRODUCCIÓN
ANTECEDENTES
Carne y productos cárnicos bajo la denominación Jamón
La norma oficial mexicana denomina "jamón" o "jamón de pierna" al producto elaborado exclusivamente con la carne de las patas traseras de un cerdo declarado para consumo humano por la autoridad responsable de acuerdo con los criterios y especificaciones generales establecidos. Sin embargo, México permite la incorporación de carne de otra especie (pavo) en la producción de jamón. Está permitido comercializar jamones que no sean de cerdo, pero se denominan
Asimismo, el término jamón de pavo está legalmente aceptado siempre que la carne provenga de la pechuga o pierna del ave.
Autenticidad en alimentos
La producción y comercialización de jamón, especialmente elaborado a partir de carne de cerdo, pavo y aves, aumenta cada día significativamente debido a la alta demanda por parte de la industria y los consumidores (Iqbal et al., 2014). Por lo tanto, en muchos casos, la verificación de la composición, el origen y el procesamiento de los alimentos se puede realizar de manera más eficiente mediante métodos analíticos (Woolfe et al., 2013). Particularmente en la industria cárnica, los productos cárnicos son vulnerables al fraude debido a las consecuencias económicas beneficiosas para el productor que se producen cuando la carne de una especie con alto valor comercial es reemplazada por una especie con menor valor (Fajardo et al., 2010). .
La presencia de adulteración en el sentido de encontrar una especie animal no declarada en la etiqueta en productos cárnicos puede detectarse mediante un análisis de proteínas o de ADN (Ballin et al., 2009); Incluso la diferenciación entre razas animales también se puede identificar con el análisis de ADN (Kaupe et al., 2004).
Fraudes y adulteración en alimentos en México y el mundo…. 7
En Turquía, se ha encontrado carne de especies no declaradas en productos cárnicos como salchichas fermentadas (salami, salchicha), también en carne cruda, ternera, jamón, tocino y carne enlatada. En México, Flores-Munguía et al., (2000) encontraron mediante un ELISA carne de especies no declaradas en el etiquetado de productos cárnicos. Llamando la atención sobre las definiciones de “Jamón”, según la norma, se trata de un producto elaborado exclusivamente con la carne de las patas traseras del cerdo (Sus scrofa domesticus), que ha sido declarado apto para el consumo humano por la autoridad responsable utilizada. , de acuerdo con los criterios generales y especificaciones establecidos en la norma; Sin embargo, también se permite el apellido.
"Jamón de pavo", que se define como un producto alimenticio, elaborado exclusivamente con la carne de los muslos de pavo, que ha sido declarado apto para el consumo humano por la autoridad competente, de la especie (Meliagridis.. 13. gallopavo), en de acuerdo con los criterios generales y especificaciones establecidos en el cuerpo de la Norma.
Técnicas analíticas utilizadas en el mundo para revelar la
- PCR en punto final
- PCR en tiempo real (qPCR)
Luego se prepararon los demás puntos de la curva (4) con sus respectivas diluciones mostradas en la Tabla 4. En la Tabla 12 se muestra un ejemplo de la cantidad de ADN extraído para el caso de muestras sometidas a tratamiento térmico. En el caso de la curva estándar porcina, a partir de ADN procedente de carne cruda, sólo se cuantificaron 100 pg.
Valores Ct de la curva estándar dúplex con ADN de cerdo y pavo sometidos a tratamiento térmico.
Apliaciones de la qPCR en alimentos 21
OBJETIVOS
Objetivo general
Objetivos específicos
La secuencia del oligonucleótido IAC y la sonda utilizada para su amplificación se muestran en la Tabla 3. La prueba de especificidad se realizó por duplicado para cada ADN de las especies mencionadas en la lista anterior, colocando 15 µL de la mezcla de reacción que contenía (2) La misma mezcla de reacción se realizó cuando se realizó la prueba para pavo, excepto la sustitución de cebadores específicos para cerdos. y sondas de hidrólisis para pavo.
Las curvas se prepararon según la metodología de Koppel et al. 2008) donde se utilizó una concentración de 20 ng/μL de ADN como primer punto y diluciones seriadas para los demás puntos de la curva. A partir de los datos obtenidos de las pendientes de las curvas estándar, se determinó la eficiencia de la qPCR multiplex mediante la ecuación 1. En la Tabla 7 se muestra el código de las mezclas de carne y el porcentaje de la proporción de cada homogeneizado.
La eficiencia (E) se calculó con la fórmula E=(10/pendiente -1) x 100, la pendiente y el coeficiente de correlación (R29) se calcularon utilizando la curva estándar. Esto se debió a que con la concentración propuesta inicialmente la eficiencia de la curva no llegaba al 90%, cada punto de la curva se corrió por triplicado y se muestran las desviaciones estándar del Ct.
Las figuras 8 y 9 muestran los resultados de la prueba de reactividad cruzada para carne de cerdo y pavo respectivamente en un solo gráfico. Además, existe el factor de que el ADN se degrada por el tratamiento térmico de la muestra.
MATERIALES Y MÉTODOS
Desarrollo del sistema qPCR
- Extracción de ADN y preparación de muestras
- Desarrollo de un Control de Amplificacion Interno (IAC)
- Prueba de reactividad cruzada
- Desarrollo de curvas estándar a partir de ADN extraído de
- Optimización de cebadores y sondas
- Desarrollo de una curva estándar dúplex de ADN a partir de
- Elaboración de mezclas cárnicas y estándares de jamón…
- Detección y cuantificación de ADN en mezclas cárnicas de
Se separaron dos tubos Falcon® de homogeneizados de cada especie y se sometieron a tratamiento térmico en baño maría hasta que la temperatura interna del homogeneizado alcanzó los 72 °C y se mantuvieron a esa temperatura durante 10 minutos, con el fin de simular el tratamiento térmico que recibe un jamón. está sujeto a su elaboración según las especificaciones de la NOM-158-SCFI-2003. Basado en la metodología de Cammà et al. 2012), se desarrolló un Control Interno de Amplificación (IAC) el cual fue sintetizado por la casa comercial IDT (UNIPARTS, USA). El ensayo de qPCR se realizó individualmente por triplicado para cerdos y pavos en un volumen de 20 μl de mezcla de reacción para cada punto de la curva.
El volumen de reacción de la mezcla consistió en 10 µL 2X Universal Mastermix Fast con ROX como normalizador de fluorescencia (Applied Biosystems, EE. UU.), 0,16 µL 200 nM de cada sonda de hidrólisis TaqMan®, 0,16 µL 200 nM cada uno de cebadores de 4,nM. - agua libre como disolvente. Después de depositar la mezcla de reacción en los pocillos de la placa, se agregaron 5 μl de ADN genómico a una concentración de 20 ng/μl para la primera mancha. Estos oligonucleótidos se dirigen al gen de la beta actina de cerdo y al gen del receptor de prolactina de pavo.
En la Tabla 5 se muestran las secuencias de cebador y sonda, así como el fluoróforo utilizado, el extintor y el tamaño de los múltiplos. El ADN de cada especie se diluyó a 10 ng/μl y dos diluciones en serie de 1:10 y 1:100. correspondiente a 3 puntos de la curva de cuantificación. Luego se hicieron dos diluciones, una 1:2 y la otra 1:, desde el primer punto de la curva (10 ng/μL) para representar los dos puntos intermedios en la curva estándar dúplex.
Cada uno de los jamones fue elaborado bajo las especificaciones de la NOM-158-SCFI-2003 con la ayuda de un Técnico en Alimentos profesional en la Planta Piloto de Productos Cárnicos ubicada en las instalaciones del CIAD (Centro de Investigación en Alimentación y Desarrollo A.C.) en la coordinación de Tecnología de los alimentos de origen animal. Con base en la metodología propuesta por Koppel et al., (2011) y con algunos ajustes, se preparó un conjunto de muestras estándar para cada una de las especies en estudio, teniendo cada conjunto un 99% peso/peso (p/p) de cada una de Posteriormente, la especie se sometió al sistema qPCR extendido. La salmuera se preparó agregando cada uno de los ingredientes que se muestran en la Tabla 8, excepto la carne, en un recipiente profundo con una capacidad de aproximadamente 10 L y se homogeneizó con una batidora de mano Oster® (EE. UU.).
Después de obtener las muestras del masajeador, se colocaron en una llenadora manual Smith RISCO RS 2050 (Smith®, NY, EE. UU.).
Validación del sistema qPCR
Es importante en este caso cuantificar el ADN con técnicas de fluorescencia después de una basada en espectrofotometría para asegurar la cantidad de ADN disponible, porque las técnicas espectrofotométricas también cuantifican ácidos nucleicos libres y ARN (ácido ribonucleico), por lo que puede haber un valor sobreestimado de ADN. 'una concentración lograda. Debido a la naturaleza compleja de la muestra (matrices cárnicas sometidas a tratamiento térmico) y los cambios que ésta ejerce sobre el ADN, es más probable que exista una gran cantidad de ácidos nucleicos libres en la solución de ADN purificado. Applied Biosystems® y las guías internacionales (Bustin et al., 2009; Dorak et al., 2006) sugieren que la eficiencia de la curva estándar en ensayos de qPCR de cuantificación absoluta es superior al 90% y alcanza un máximo del 110%.
Una mayor eficiencia también puede deberse a un exceso de cantidad de ADN, por lo que siempre se recomienda realizar diluciones seriadas para preparar una curva estándar para realizar el menor número de pasos de pipeteo posibles (Bustin et al., 2009; Koppel et al., 2008). La eficiencia de amplificación de qPCR debe establecerse utilizando curvas estándar para que cada punto se realice por triplicado. La curva es extremadamente importante ya que proporciona una indicación simple, rápida y reproducible de la eficiencia de la PCR, la sensibilidad analítica y la solidez del ensayo qPCR (Bustin et al., 2009).
Relación de los valores de Ct con el contenido de ADN en curva de calibración de carne de cerdo cruda. Relación de los valores de Ct con el contenido de ADN en la curva de calibración de carne cruda de pavo. Dado que hay menos cantidad de ADN diana, la concentración de las sondas de hidrólisis y los cebadores debe ser menor ya que hay menos, o de lo contrario la eficiencia de la reacción excederá el 110% ya que hay múltiples sondas de hidrólisis y cebadores en exceso.
Sin embargo, es importante destacar que en el sistema qPCR propuesto, el 1% (30 g en 3000 g) de las especies animales involucradas en los jamones producidos en la planta piloto fue detectable por el equipo. El límite de cuantificación se calcula con la linealidad del sistema, en el caso de la curva estándar dúplex, los valores del coeficiente de correlación (R2) fueron 0,994 para el cerdo y 0,997 para el pavo, por lo que se realizó la interpolación de la concentración. de las muestras problemáticas se mantiene en un sistema lineal. El LOQ es la cantidad más pequeña que se puede cuantificar en relación con la curva estándar y que la variación en la cuantificación es razonable (típicamente del 90 al 110% de eficiencia), aunque se han informado trabajos con eficiencias de hasta el 80% (Laube et al. , 2007).
Si se calcula el coeficiente de variación de la cantidad de ADN obtenido con cada mezcla se encuentra que es menor al 25%, lo que demuestra la validez de indicar el verdadero valor del sistema qPCR propuesto.
