Emmanuel Aispuro Hernández, por siempre tener el tiempo para asesorarme en mi trabajo experimental, por el tiempo que invirtió en mi trabajo, por las palabras de aliento, gracias por los consejos, por el apoyo técnico en el laboratorio, gracias por todo. Francisco Soto, por su ayuda para completar la obra de este maestro y también gracias por las palabras de aliento.
INTRODUCCIÓN
Además de estimular efectos fisiológicos beneficiosos para la salud, pueden estimular el antagonismo de las BAL contra patógenos humanos (Roberfroid et al., 2010). La primera característica es que no debe ser absorbido ni hidrolizado en el tracto gastrointestinal, resistiendo así la acción de los ácidos del estómago y las enzimas digestivas (Roberfroid et al., 2010).
ANTECEDENTES
- Inocuidad Alimentaria: Reto a Vencer a Nivel Mundial
- Melón Cantaloupe (cucumis melo L.)
- Microorganismos Presentes en la Superficie de Frutos y Hortalizas, y su
- Estimulación del Poder Antagonista con Oligosacáridos
- Uso de la Inulina Como Oligosacárido No Digerible
- Fructooligosacáridos Utilizado Como Fuente de Carbono
- Oligosacáridos de Pectina: Como Inductor Potencial de Actividad
- Oligosacáridos de ácido poligalacturónico Como Estimulador de la
La inulina es un polisacárido compuesto por unidades de D-fructosa unidas por enlaces β (1→2) que tienen un residuo de glucosa al final (Figura 2) (Causey et al., 2000). Los FOS son los prebióticos más utilizados y estudiados en el mercado (Manderson et al., 2005).
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
Objetivo General
Objetivos Específicos
MATERIALES Y METODOS
- Material Vegetal
- Cepas y Oligosacáridos Utilizados
- Aislamiento de BAL Presentes en el Epicarpio de Melón Cantaloupe
- Oligosacáridos
- Medios de Cultivo
- Bacteria Patógena y Bacteria Ácido Láctica Testigo
- Determinación de Antagonismo de aislados de Bacterias Ácido Lácticas
- Selección de Aislados por Pruebas Bioquímicas y Morfológicas
- Determinación de la Tasa de Crecimiento de los Aislados de BAL y
- Obtención de Parámetros Cinéticos
- Determinación del Potencial Antagonista in vitro de los Aislados de
- Identificación de los Aislados de Bacteria Ácido Láctica Seleccionados
- Identificación por Secuenciación del Gen 16S Ribosomal
- Identificación Microbiológica por Fermentación de Carbohidratos
- Análisis Estadístico
- Determinación de Antagonismo de Aislados de Bacterias Ácido Lácticas
- Determinación de la Tasa de Crecimiento de los Aislados de Bacterias
- Determinación del Potencial Antagonista in vitro de los Aislados de
- Evaluación de la Actividad Antagónica in vivo de Aislados de Bacterias
Los oligosacáridos del ácido poligalacturónico (OAPG) y los oligosacáridos pécticos (OP) con un grado de polimerización (GP) de 3-20 fueron obtenidos en el laboratorio de Fisiología Vegetal-Molecular del CIAD, mediante hidrólisis enzimática del ácido poligalacturónico (Sigma-Aldrich), por la metodología de Ochoa -Villareal et al., 2012. Los oligosacáridos se agregaron a los medios de cultivo a una concentración de 1% p/v, se estabilizaron a un pH final de 6.2 y se esterilizaron a 121°C durante 15 minutos según lo descrito. por Saarela et al. Se tomaron muestras de los aislados de BAL con un asa y se inocularon en caldo MRS para su crecimiento. Se incubó a 37°C por 24 horas, transcurrido ese tiempo se tomó una muestra del caldo MRS y se inoculó por estrías en placas de agar MRS y se incubaron a 37°C por 24 horas, luego de lo cual las colonias aisladas se llevaron a extraer el inóculo, en solución salina al 0,85% se ajustó el inóculo inicial a una concentración de 1x106 UFC/ml (0,1 absorbancia a 600 nm), del cual se tomó 1 ml y se añadió al matraz que contenía caldo MRS modificado sin glucosa ( según la formulación descrita en el apartado V.2.2), suplementados con oligosacáridos pécticos y oligosacáridos derivados del ácido poligalacturónico individual, una concentración del 1% p/v, la prueba se realizó por triplicado. Las tasas de crecimiento (h-1) y la densidad óptica máxima (ODmax) de los aislados bacterianos se calcularon utilizando el programa Growth Rates 2.0, con base en las densidades ópticas registradas en las curvas de crecimiento (Hall et al., 2013).
Se tomaron muestras de epicarpio de 7 melones, de los cuales 4 secciones por melón de aprox. La inoculación de BAL y Salmonella Typhimurium se realizó según la siguiente metodología: se tomaron muestras tostadas de aislados de BAL congeladas y se reactivaron en tubos con caldo MRS, luego se tomaron 20 µL de inóculo y se transfirieron a tubos con caldo. MRS modificada suplementada con OGAS y OP-oligosacáridos al 1% p/v. Posteriormente, se tomaron muestras de los tubos con crecimiento y se sembraron en placas de Petri con agar MRS para LAB y con agar TSA para S.
El ADN genómico extraído se usó como plantilla en una reacción en cadena de la polimerasa con los cebadores universales sentido 27FW (5'-AGAGTTTGATCMTGCTCAG-3') y antisentido 1492 RV (5' TACGGYTACCTTGTTACGACTT 3'), además de los componentes que se muestran en la Tabla 4.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Capacidad Antagónica y Caracterización Bioquímica de Aislados
Estas sustancias pueden ser péptidos de bajo peso molecular como bacteriocinas y peróxido de hidrógeno, además de ácidos grasos de cadena corta (AGCC), ácido láctico, que baja el pH del medio y provoca la muerte de las bacterias patógenas. compiten por los nutrientes (Casas y Dobrogosz, 2000; Hudault et al., 1997; Lievin et al., 2000). Aislados bacterianos de la superficie de melón cantalupo con actividad antagonista (A) y sin actividad antagonista (B), catalogados por la presencia de zonas de inhibición >0.4 mm contra S. Typhimurium, mostraron resultados negativos para la prueba de catalasa, lo que indica que este grupo de microorganismos carecen de la presencia de esta enzima y no pueden descomponer el peróxido de hidrógeno en agua y oxígeno.
Para proceder a la supuesta identificación de aislados de epicarpio de melón con actividad antagonista, se clasificaron mediante tinción de Gram (Tabla 6). Por tanto, los resultados de esta fase sugieren que entre los 78 aislados antagonistas, los aislados Gram positivos pueden corresponder a BAL. Para trabajar con BAL en las últimas etapas del presente estudio, se descartaron los aislados Gram negativos.
Un total de 43 aislados del epicarpio de melón cumplieron algunas de las características de las bacterias lácticas (tinción de Gram positiva, catalasa y oxidasa negativa), de los cuales se seleccionaron entre sí aquellas con mayor halo de inhibición y diferente morfología (Tabla 7). . .
Efecto de Oligosacáridos en el Crecimiento y Potencial Antagonista
Con el objetivo de seleccionar aquellas BAL aisladas del epicarpio de melón que superaron a Salmonella Typhimurium en cuanto a la capacidad fermentativa de los oligosacáridos evaluados en el presente estudio, la tasa de crecimiento específico (h-1) (Cuadro 8) y la densidad calculada. óptica (DOmax) (Tabla 9) de cada aislado bacteriano y se comparó con la del patógeno. Esto indica que el microorganismo puede adaptarse fácilmente a este medio de cultivo, de lo contrario en presencia del OAPG las cepas mostraron el. Además, con el objetivo de conocer cuál de los tratamientos promovió más el crecimiento de las BAL aisladas del epicarpio de melón, en la Figura 10 se muestra la tasa de crecimiento promedio de los aislados en el.
La tasa de crecimiento media fue significativamente mayor en presencia de OAPG (P≤ 0.05) que en el resto de los tratamientos con inulina, FOS y OP, lo cual concuerda con los datos del Cuadro 8, donde se muestran las tasas de crecimiento como parámetro. de adaptación de las bacterias a diferentes medios de cultivo, indicando que el melón cantalupo posee LAB en su microbiota con capacidad de adaptarse mejor que S. De los siete aislados bacterianos analizados, solo dos mostraron una estimulación significativa (P≤ 0.05) en su capacidad antagonista frente al patógeno, con incrementos en la zona de inhibición de 1,3 y 2,1 veces para los aislados 170 y 45, respectivamente, entre ellos la producción de sustancias antimicrobianas, bacteriocinas o el aumento del número de bacterias beneficiosas que compiten por el espacio y/o la nutrición. con bacterias patógenas. 2005) encontraron que los OP promueven el crecimiento de LAB como Bifidobacterium, además de aumentar la concentración de ácido láctico en comparación con la fermentación de FOS.
La fuente de carbohidratos determinará la regulación de las tasas de fermentación y los perfiles de los productos finales, como la síntesis de diferentes ácidos (Hove, Nordgaard-Andersen y Mortensen, 1994).
Identificación de los Aislados de BAL por Técnicas Moleculares
Con los datos obtenidos de la base de datos GenBank se determinó que el aislado bacteriano 45 correspondía a una cepa de Enterococcus faecalis. El análisis de secuencia mostró una alta identidad entre los aislados 170 y 175 con las cepas Pediococcus acidilactici, Pediococcus pentosaceus y Pediococcus lolli. Como resultado de lo anterior, la identificación exacta de estas cepas es objeto de amplios estudios, donde se recomiendan pruebas moleculares más específicas, como la amplificación del gen de la D-lactato deshidrogenasa (Mora et al., 1997; Barros et al. ., 2001) . , a partir del uso de técnicas de crecimiento diferencial y fermentación de azúcares específicos (Doi et al., 2009).
Para identificar los tipos de aislados 170 y 175 se utilizó una estrategia basada en la descrita por Mora et al., (1997), quienes diseñaron un par de cebadores con la capacidad de reconocer una región específica del gen ribosómico 16S. representa una variación de sólo dos pares de bases. El análisis de secuencia de los aislados 170 y 175 mostró que la identidad de ambos aislados coincidía con la de P. Como se mencionó anteriormente, los aislados 170 y 175, que ya habían sido identificados como una bacteria, se aislaron en etapas anteriores de este estudio. género Pediococcus, mostró diferencias en las características cinéticas durante la fermentación de oligosacáridos.
Algunas de las diferencias que se han informado entre las cepas de P. pentosaceus han sido reportadas por Lee et al.
Estimulación de la Actividad Antagónica de Pediococcus pentosaceus y
Viabilidad de Salmonella Typhimurium en presencia de Enterococcus faecalis (control), Efecto de OAPG sobre la viabilidad de S. Typhimurium en presencia de Enterococcus faecalis (tratamiento), Viabilidad de Enterococcus faecalis,………. Viabilidad de Salmonella Typhimurium. Efecto de los oligosacáridos del ácido poligalacturónico (OAPG) sobre la viabilidad de Salmonella Typhimurium en presencia de Pediococcus pentosaceus.
Viabilidad de Salmonella Typhimurium en presencia de Pediococcus pentosaceus (control), Efecto de OAPG sobre la viabilidad de S. Typhimurium en presencia de Pediococcus pentosaceus (tratamiento), Viabilidad de Pediococcus pentosaceus, ………. Viabilidad de Salmonella Typhimurium. Efecto de los oligosacáridos pécticos (OP) sobre la viabilidad de Salmonella Typhimurium Viabilidad de Salmonella Typhimurium en presencia de Pediococcus pentosaceus (control), Efecto de los OP sobre la viabilidad de S.
Typhimurium en presencia de Pediococcus pentosaceus (tratamiento), Viabilidad de Pediococcus pentosaceus,….Viabilidad de Salmonella Typhimurium.
Curvas de crecimiento de los aislados de BAL seleccionados, en presencia de los diferentes oligosacáridos (continuación). Curvas de crecimiento de los aislados de BAL seleccionados, en presencia de los diferentes oligosacáridos (continuación).
Una revisión de bacterias bacteriocinógenas ácido lácticas utilizadas como cultivos bioproductores en carne fresca producida en Argentina. Efecto del consumo de fibra dietética sobre la expresión cuantitativa del receptor de butirato GPR43 en el colon de rata. Purificación y caracterización de una enzima pectinasa producida por Aspergillus niger mediante la técnica de fermentación sólida.
The influence of lactic acid bacteria on the intestinal production of lactate and short-chain fatty acids and on the absorption of lactose. In vitro determination of prebiotic properties of oligosaccharides obtained from the by-product stream of orange juice production. Effect of lactulose lactitol and lactobionic acid on functional and technological properties of potentially probiotic Lactobacillus strains.
Short-chain oligogalacturonides induce ethylene production and expression of the gene encoding aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase in tomato plants.