INTRODUCCIÓN
ANTECEDENTES
- Calidad y Pérdidas Postcosecha del Tomate
- Pared Celular y sus Componentes
- Polisacáridos Pécticos y su Función en la Pared Celular
- Estructura y Función de los Ramnogalacturonanos I y II (RG I
- Efecto Elicitor de Fragmentos Pécticos en el Mecanismo de
Durante la división celular, el control de la expansión resulta de la presión de turgencia, que depende de cambios en la extensibilidad de la pared celular primaria (Sénéchal et al., 2014). La metilesterificación/desesterificación de los polisacáridos de pectina de la pared controla el crecimiento celular, la maduración de la fruta y protege a las plantas contra el estrés biótico (Lionetti et al., 2012). Se encontraron cantidades significativas de RG I en la pared primaria y en la hoja media de la papa (Solanum toberosum) (Bush et al., 2001).
Los residuos de galactosa se encuentran en los polisacáridos de la pared como los arabinogalactanos (AG), los xiloglucanos (XiG) y los ramnogalacturonanos I (RG I), pero sólo se encuentran en el RG I como (1, 4) -β-D-galactano, así como en arabinogalactanos (Almeida y Carpita, 2006). A pesar de su complejidad, la conservación de la estructura RGII en plantas sugiere que debe desempeñar un papel importante en la función de la pared celular (O'Neill et al., 2004). En el tabaco (Nicotiana tabacum) y Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), se ha demostrado que la expresión de la poligalacturonasa (PG) fúngica y la consiguiente reducción de homogalacturonanos (HG) en la pared celular aumentan la resistencia a los patógenos (Ferrari et al., 2007).
OBJETIVOS
Objetivo General
Objetivos Específicos
MATERIALES Y MÉTODOS
Etapa I. Obtención y Caracterización Parcial de Fragmentos de
- Caracterización Parcial de RG I y sus Fragmentos
- Determinación de las Bandas de Absorción Asociadas a
- Determinación del Contenido de Ácido Galacturónico
Los espectros de absorción infrarroja de RG I y sus fragmentos se obtuvieron utilizando la técnica de reflectancia total atenuada (ATR) en un espectrofotómetro infrarrojo por transformada Thermo Scientific Nicolet Fourier, modelo iS50. La determinación de la distribución de pesos moleculares se realizó según la técnica reportada por Carvajal-Millan et al. Se usó como eluyente una solución tampón de nitrato de sodio 50 mM que contenía azida de sodio al 0,02% (p/v) como agente antibacteriano a un caudal de 0,5 ml/min.
El perfil de azúcar en las fracciones RG I se determinó según la técnica reportada por Blakeney et al. 1983), donde se llevó a cabo la hidrólisis, seguida de la reducción y la acetilación. Reducción: Se redujeron alícuotas de 0,15 ml con 1 ml de solución de borohidruro de sodio/dimetilsulfóxido (NaBH4/DMSO). Posteriormente, las muestras se colocaron a 35°C durante 90 min, y luego se eliminó el exceso de NaBH 4 agregando 0,1 mL de ácido acético glacial y se dejó enfriar en hielo.
Acetilación: A la mezcla anterior se le agregaron 0,15 ml de metilimidazol con 2 ml de ácido acético anhidro, se dejó enfriar a temperatura ambiente durante 20 minutos y se agregaron 2 ml de cloroformo. Se agregaron 6 mL de agua milli-Q para eliminar el exceso de ácido, se agitó y se dejó decantar, se separó en dos fases, de las cuales se eliminó la fase superior con una pipeta Pasteur (los lavados con agua se repitieron 3 veces) y la fase inferior. Se recuperó, cuidando de no extraer agua, y se colocó en viales inyectables de 1 mL. Condiciones cromatográficas: Se utilizó una columna tipo BD225 (50% cianopropilfenildimetilpolisiloxano, Teknokroma) de 0,32 mm x 30 m en un cromatógrafo de gases modelo Agilent Technologies 6890N usando hidrógeno como gas portador y un detector de índice de refracción.
Los estándares se prepararon a una concentración de 1 mg/ml con agua ultrapura, se agregaron 0,4 ml de H2SO4 7,5 N y 0,5 ml de amoniaco al 25% y se siguieron todos los pasos descritos para la hidrólisis, reducción y acetilación, excepto que no lo dejes. al baño maría durante 2 horas. Se determinó el contenido de ácido galacturónico en el RG I no fraccionado y en las fracciones.
- Selección del Material Vegetal
- Aplicación de Fragmentos de RG I…
- Determinación de la Concentración de Proteína
- Obtención de Extracto Proteico y Determinación de la
- Obtención de Extracto Proteico y Determinación de la
Obtención de extracto proteico y determinación de la actividad enzimática de la β-1,3-glucanasa. Actividad enzimática de la β-1,3-glucanasa. La determinación de la actividad enzimática se realizó mediante el método del ácido 3,5-nitrosalicílico (ADN) reportado por Abeles (1970) y Chaplin (1986) con modificaciones. La actividad específica de la β-1,3-glucanasa se definió como la cantidad de enzima que cataliza la formación de 1 mmol de glucosa liberada/min.mg de proteína y los resultados se informaron como U/mg de proteína.
A partir del extracto proteico preparado en el apartado anterior se determinó la actividad quitinasa mediante fluorometría, según el método de Cota et al. Después de la incubación, la reacción se detuvo agregando inmediatamente al blanco y a la muestra 150 µL de Na2CO3 0,2 M. La actividad se determinó basándose en la fluorescencia usando una curva de calibración de 4-Mu, que se preparó a partir de una solución madre de 4-Mu 1 M. Mu se disolvió en Na2CO3 0,2 M, a partir del cual se prepararon concentraciones de 10-500 mM de 4-Mu.
La actividad específica de la enzima quitinasa se definió como la liberación de 1 µmol de 4-Mu/min.mg de proteína. Se obtuvo un extracto proteico de la pulpa liofilizada de tomate para la determinación enzimática de peroxidasa, según el método reportado por Lamikanra (1995) con algunas modificaciones. La determinación de la actividad enzimática se realizó según el método de Flurkey y Jen (1978) con las siguientes modificaciones.
La actividad específica de la peroxidasa se definió como la formación de 1 mmol de tetraguaiacol/min.mg de proteína y los resultados se informaron en U/mg de proteína. Para la fase de caracterización de los fragmentos del RG I se utilizó análisis descriptivo.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
- Análisis de las Bandas de Absorción Asociados a Enlaces
- Determinación de la Viscosidad Intrínseca y Peso Molecular
Por otro lado, según el estudio reportado por Mckie et al. 2001), donde los galactanos pécticos de papa degradados con RGL, detectaron los productos de degradación mediante HPLC. O enlazado a los ésteres, indicando que en el RG I no fraccionado está desmetilesterificado. Otros estudios asocian una banda a 1072 cm-1 con unidades de galactosa presentes en el RG I (Kacurakova et al., 2000), banda que se observó en este estudio, sugiriendo la presencia de galactosa en el RG I de papa.
Además, la altura de la banda observada en la región 1500-1650 cm-1 y asociada con grupos carboxilo disminuyó en comparación con la observada en RG I no fraccionado. El perfil de distribución de peso molecular de RG I se muestra en el cromatograma de la Figura 9. RG El que utilicé en este estudio fue de la empresa comercial Megazyme (Mckie et al., 2001).
Los resultados de la distribución del peso molecular por dispersión de luz (LS), la presencia de proteína determinada por luz ultravioleta (UV) y azúcares determinada por índice de refracción (RI) en el RG I no fraccionado y sus fracciones se presentan en la Figura 10. La absorbancia UV (280 nm) permite observar la presencia de proteína tanto en el RG I s/f como en el fraccionado; en el que su concentración parece haber disminuido ligeramente (Goh et al., 2006). La Tabla 2 muestra la composición de azúcares neutros y ácido galacturónico del RG I (s/f) no fraccionado y los fragmentos.
En RG I s/f, el alto contenido de galactosa (10%) indica la presencia de cadenas laterales de galactano y en menor medida mananos (1% manosa) y arabinoxilanos (relación Ara/Xyl 0,65). En los tres fragmentos aumenta el contenido de azúcares neutros y disminuye el contenido de ácido galacturónico, el mismo comportamiento se puede observar en el índice de refracción que se muestra en la Figura 10.
- Efecto de los Fragmentos de RG I en la Actividad Enzimática
- Efecto de los Fragmentos de RG I en la Actividad Enzimática
La Figura 11 muestra los resultados de la actividad específica de la enzima β-1,3-glucanasa en tomate aplicada con los fragmentos RG I, en relación al tiempo de exposición. Se puede observar que los fragmentos no tuvieron un efecto significativo sobre los niveles de actividad enzimática durante la primera hora después de la aplicación. Los niveles de actividad quitinasa específica en frutos de tomate aplicados con fragmentos de RG I se muestran en la Tabla 4.
La Figura 13 muestra los resultados del efecto de la aplicación de fragmentos de RG I sobre la actividad específica de quitinasa en frutos de tomate en relación al tiempo. Se ha demostrado que los fragmentos pécticos con características RG I inducen actividad quitinasa en tejidos vegetativos (Dinand et al., 1997; Boudart et al., 1998). Es posible que debido a esto, la actividad quitinasa disminuya con el tiempo de exposición.
La Tabla 5 muestra los resultados de la actividad peroxidasa específica en tomates tratados con fragmentos de RG I. Muestra que los tratamientos no provocaron un cambio en la actividad enzimática del tomate. La Figura 14 muestra los resultados del efecto de los fragmentos de RG I sobre la actividad de la enzima peroxidasa con respecto al tiempo de exposición.
La aplicación del fragmento F-2 30 minutos después de la aplicación provocó un aumento de la actividad de esta enzima en 1,8 veces respecto al control. Estas diferencias en los niveles de peroxidasa con respecto al tiempo pueden deberse a los diferentes pesos moleculares de los fragmentos y las características estructurales mencionadas anteriormente.
CONCLUSIÓN…
RECOMENDACIONES
Egg-box conformation of oligogalacturonides: the time-dependent stabilization of the elicitor-active conformation increases its biological activity. Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. In vitro characterization of the homogalacturonan-binding domain of the wall-associated kinase WAK1 using site-directed mutagenesis.
The endogenous elicitor, a fragment of a plant cell wall polysaccharide that induces phytoalexin accumulation in soybean. Structure of the backbone of rhamnogalacturonan I, a pectic polysaccharide in plant primary cell walls. Structural studies by stepwise enzymatic degradation of the backbone of soybean soluble polysaccharides consisting of galacturonan and rhamnogalacturonan.
Crystallization and preliminary X-ray analysis of the rhamnogalacturonan lyase YesW from Bacillus subtilis strain 168, a member of the polysaccharide lyase family 11. The Arabidopsis irregular xylem8 mutant lacks glucuronoxylan and homogalacturonan, which is an essential cell wall integron essential for the cell wall. Xyloglucan-pectin bonds are formed intraprotoplasmically, contribute to wall assembly and remain stable in the cell wall.
Expansion of the receptor-like kinase/Pelle gene family and receptor-like proteins in Arabidopsis. Short-chain oligogalacturonides induce ethylene production and expression of the gene encoding aminocyclopropane-1-carboxylic acid oxidase in tomato plants.