Los puntos de cada cuadro representan del 25% al 75% de los datos, la línea en el medio del…. Por tanto, se ha secuenciado el gen de la miostatina de varias especies de peces de alto valor comercial (Funkenstein et al., 2009). El gen de la miostatina en los peces tiene tres exones que están altamente conservados incluso en otros mamíferos y aves (Ye et al., 2007).
Se sabe poco sobre la función de la miostatina en otros tejidos. Caracterizar la región codificante y el patrón de expresión del gen de la miostatina en pargo flamenco (Lutjanus guttatus) durante el desarrollo embrionario, larval y juvenil.
Objetivo 1. Aislar, secuenciar y caracterizar la región codificante del gen de miostatina en pargo flamenco (Lutjanus guttatus) mediante
Utilizando aislar, secuenciar y caracterizar la región codificante del gen de la miostatina en flamenco (Lutjanus guttatus). Se preparó un análisis para medir distancias euclidianas utilizando el algoritmo UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Average) y el modelo de Jukes Cantor. Las secuencias ortólogas de miostatina se obtuvieron del NCBI (National Center for Biotechnology Information) y se seleccionaron según el análisis realizado por Rodgers & Garikipati (2008) para identificar la isoforma en la que se está trabajando.
Para la cuantificación de la expresión del gen de la miostatina, se diseñaron oligos específicos de la secuencia de miostatina obtenidos para la especie (L. guttatus) con el programa PRIMER 3 (Rozen & Skaletsky, 2000), el cual un fragmento de 154 pb, ubicado en la región 3', amplificado. (Tabla 3). Se eligieron dos genes de referencia para la normalización de la expresión génica, el ARNr 18S y la β-actina. 24 Para calcular la expresión relativa de miostatina, se utilizó el procedimiento utilizado por Sifuentes-Romero et al. fue usado, seguido. 2010) basado en el método CT comparativo (2-ΔCT) propuesto por Livak & Schmittgen (2001), la linealización de los datos de expresión génica y el uso de β-actina para la normalización de la expresión.
Se comparó la existencia de diferencias significativas en la expresión de miostatina en dos grupos de peso: el grupo 1, correspondiente a organismos con peso inferior a la media, y el grupo 2, organismos con pesos superiores a la media. A continuación, se subdividieron tres grupos de peso por debajo del promedio y tres grupos de peso por encima del promedio para determinar diferencias en la expresión de miostatina en relación al peso de los organismos, mediante la aplicación de un ANOVA de una vía, con comparaciones pareadas de Fisher. , en los casos en los que se encontraron diferencias significativas. La existencia de diferencias significativas en los niveles de expresión y entre grupos de peso durante el desarrollo juvenil se evaluó mediante la realización de un análisis de varianza de dos vías (ANOVA) y una prueba de comparación pareada de Fisher (LSD) en los casos en que se encontraron diferencias significativas entre los factores ( edad versus niveles de expresión de miostatina) que cubren el desarrollo embrionario, larvario y juvenil.
Los oligos utilizados para la cuantificación de la expresión génica fueron los mismos mencionados en el Objetivo 2, así como los procedimientos de análisis de estabilidad genética de referencia realizados para cada órgano. Se realizó PCR de punto final en cada extracción y síntesis de ADNc con los protocolos y condiciones descritos en el Objetivo 2. Se utilizó un análisis de varianza unidireccional con comparaciones pareadas de Fisher (LSD) entre todos los órganos obtenidos para evaluar la existencia de diferencias significativas en miostatina. niveles de expresión.
Utilizando oligos diseñados para obtener la transcripción de miostatina descrita en el objetivo 1 (Fish-Mstn-F2 y Fish-Mstn-R2), intentamos aislar. 27 transcritos en tejidos no musculares que expresan miostatina, como el cerebro, las branquias y los ojos, para determinar si son la misma isoforma de miostatina. Las condiciones y protocolos para la amplificación, purificación, clonación, secuenciación, identificación y caracterización de los transcritos encontrados en el cerebro y las branquias se realizaron de la misma manera que se describe en el Objetivo 1.
Como el cerebro representaba los niveles más altos de expresión de miostatina, junto con el hecho de que se ha informado de una segunda isoforma de miostatina en este órgano, se decidió aislar primero la transcripción del cerebro. Para obtener la transcripción completa de la miostatina en el cerebro se utilizó la técnica SMARTERTM RACE cDNA (SMART RACE cDNA amplification) de Clontech, en la que primero se sintetiza el cDNA de RACE a partir de un ARN al que se incorpora un oligo modificado químicamente. secuencia, una para 5' y otra para 3'. Luego se realizó una reacción de PCR RACE con oligos específicos para la secuencia deseada y oligos universales del kit RACE.
Aislar, secuenciar y caracterizar la transcripción completa del gen de la miostatina en pargo flamenco (Lutjanus guttatus) utilizando.
Objetivo 1. Aislar, secuenciar y caracterizar el transcrito completo del gen de miostatina en pargo flamenco (Lutjanus guttatus) mediante
Sin embargo, se encuentran sólo en ortólogos de miostatina y no en otros miembros de TGF-β (Rodgers et al., 2001). Sitios conservados del gen de la miostatina perteneciente a la familia del factor de crecimiento transformante beta (TGF-β). El patrón de expresión de la miostatina en los peces parece ser diferente del de los embriones de ratón, donde los niveles de ARNm en los somitas en desarrollo son altos, mientras que en los peces es prácticamente indetectable.
Algunos autores han sugerido que los cambios en la expresión de miostatina se deben a cambios en el desarrollo embrionario, por ejemplo en L. Los patrones de expresión del gen de miostatina en peces indican que puede estar involucrado en las primeras etapas del desarrollo muscular (Helterline et al., 2007). Esto es sorprendente dados los niveles muy bajos de expresión de miostatina durante el desarrollo embrionario (Helterline et al., 2007).
Por otro lado, Lates calcarifer presenta altos niveles de expresión de miostatina alrededor de la eclosión (De Santis et al., 2012), a diferencia de lo encontrado en Lutjanus guttatus, donde la expresión de miostatina se mantiene en niveles basales. Por tanto, como ya mencionaron Rodgers et al. 2001), la miostatina no se expresa constitutivamente en las larvas en desarrollo, su expresión parece estar regulada, lo que también sugiere que la expresión de miostatina aumenta con el inicio de la actividad muscular en las larvas en desarrollo y, por lo tanto, con el desarrollo muscular. De esta forma, podemos describir los días de mayor y menor nivel de expresión de miostatina durante el desarrollo embrionario, larval y juvenil de L.
44 Aunque hay pocos estudios que describan la expresión de miostatina durante el desarrollo en peces, es importante señalar que si los parálogos del gen afectan el desarrollo de los peces de manera diferente, se espera que los patrones de expresión en los peces sean diferentes con diferentes mecanismos de crecimiento muscular (De Santis et al. , 2012).
La correlación peso-miostatina fue baja aunque significativa (r=-0.195, p=0.03, n=124), observándose que los organismos más pequeños tienen mayores niveles de expresión de miostatina. Grupo 1 correspondiente a organismos con pesos menores al promedio y grupo 2 correspondiente a organismos con pesos mayores al promedio, para determinar diferencias en la expresión de miostatina mediante un ANOVA de una vía, encontrando diferencias significativas (p<0.05) (Tabla 7 y Figura 26). Una vez determinada la existencia de diferencias significativas en la expresión de miostatina entre organismos que tienen pesos inferiores a la media respecto a aquellos que tienen pesos superiores a la media, se realizaron subgrupos de peso para ver qué pesos los agrupan. niveles de expresión.
Esto sugiere que los organismos de bajo peso tienen niveles más altos de expresión de miostatina. Cuando los organismos alcanzan unos 6,6 g, en este caso la media como referencia, la expresión de miostatina disminuye. La expresión del transcrito de miostatina fue detectada en los diez órganos anteriormente mencionados mediante la PCR final, aunque el análisis es cualitativo, permite determinar diferencias en el nivel de expresión de miostatina, lo cual fue confirmado mediante PCR en tiempo real.
Las comparaciones pareadas según el método de Fisher indican que el tejido muscular, el cerebro, los ojos y las branquias no difieren significativamente entre sí, pero muestran una diferencia significativa en la expresión de miostatina. El cuadro de línea continua muestra la eliminación de 75 nt en la transcripción de miostatina-1b cerebral. De manera similar, es necesario aislar los transcritos de miostatina en el ojo y las branquias porque la expresión también es alta en estos tejidos.
Se recomienda el análisis de la expresión del gen de la miostatina en el bazo porque se ha sugerido que la miostatina podría influir en el desarrollo de las células del sistema inmunológico en los peces.
Síntesis cDNA
Extracción de RNA con trizol con 2 digestiones
33. Una vez repetidos los pasos, se añaden 40 ml de agua DEPC para resuspender el sedimento final.
Purificación de producto de PCR cortados de gel
NOTA: Los pasos 14 y 15 se pueden realizar dos veces, agregando agua en dos pasos antes de almacenar a -20 °C.
Ligación
Transformación
8.- Incubar en 1.5 ml de SOC (en campana), primero agregar 750 ml al tubo falcon y los 750 ml restantes al tubo eppendorf con las bacterias.
Levantamiento de colonias
MInipreps (tratamiento alcalino para obtener plásmido)
6.- Centrifugar por 1 minuto a máximo 12.000 rpm y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo (puede formar un sobrenadante cremoso, se debe retirar con la misma punta y tener cuidado de no transferirlo con el sobrenadante al tubo limpio tubo).
Digestión
Preparación de medio LB-AMP
6.- Almacenar cajas de Petri con medio LB-Amp en el empaque. Una vez que estén firmes, darles la vuelta.
SÍNTESIS DE cDNA para RACE
PCR RACE 5’ – 3’
PCR RACE ANIDADO 5’
Objetivo 2
Objetivo 3
87 2.5 Comparaciones pareadas con el método Fisher LSD (ANOVA de 2 vías) Comparación del factor edad Diferencia de medias LSD(alfa=0,050) P Diferencia >= LSD.
INTRODUCTION 47
Myostatin pathway is blocked in freshwater fish to obtain giant phenotype; 79. 2009) generated a recombinant soluble form of the activin receptor 80. ActRIIB) N-terminal domain of goldfish (Carassius auratus) administered 81. African catfish (Clarias gariepinus) and tilapia (Oreochromis aureus), causing a dose-dependent increase in muscle growth is achieved. Also, myostatin transcript has been silenced by the administration of dsRNA via microinjection to zebrafish embryos 85 .
MATERIALS AND METHODS 98
Primer sets to obtain the 5' and 3' regions of the Mstn transcript were Fish-Mstn-F1/R1 and 122. 6 coupled to the Jukes Cantor model using the MEGA 4 software. perform this analysis was obtained from GenBank according to Rodgers et al.
RESULTS 177
DISCUSSION 213
Santis et al., 2012) which is faster than in zebrafish. highest levels of Mstn expression at hatching, decreasing by 3 hh, increasing again 239. to 30 hh, then decreasing to minimal levels due to the high rate of growth observed 240. Finally , at 21 dph, expression levels increase 241. similar in L. guttatus at 28 dph), coinciding with the onset of metamorphosis (De Santis 242. These results indicate, as suggested by that myostatin is not constitutively expressed, but expression is 244.
CONCLUSION 294
ACKNOWLEDGMENTS 307
