Espectroscopia de plasmón de superficie como técnica para la
Tipos de instrumentación SPR
Esta variación se puede observar como un cambio en una de las características de la onda incidente. Con base en la configuración del sistema óptico, que determina la característica de la onda medida, los instrumentos SPR se pueden clasificar en tres grupos: (1) aquellos donde se monitorea en ese momento el ángulo de incidencia en el que se produce el mínimo de luz reflejada. ; (2) instrumentos donde se monitorea la longitud de onda versus el tiempo y (3) instrumentos donde se monitorea el porcentaje de reflectividad medido en un ángulo fijo. En este caso se excita una superficie del sensor relativamente grande, de modo que la reflectividad medida es un promedio del área iluminada, lo que contribuye a mejorar la relación señal-ruido.
En el segundo grupo se encuentran los dispositivos SPR con modulación de longitud de onda. La fuente de excitación es una luz policromática y el detector es un espectrofotómetro que monitorea el cambio de la longitud de onda en la que se produce la resonancia (Figura 3.5.(B)). Waltham, MA, USA) comercializa un instrumento basado en esta configuración. Configuraciones ópticas más comunes para medir el fenómeno SPR: (A) modulación angular; (B) modulación de longitud de onda y (C) modulación de intensidad.
Esta casa comercial ha diseñado un sistema de microfluidos que permite el transporte continuo de muestras sobre la superficie del sensor a un ritmo controlado.
Preparación de la fase sensora para la caracterización de los
Inmovilización del aptámero sobre la superficie del sensor…
De esta manera, será posible evaluar, si las hubiera, interacciones inespecíficas de la tobramicina con la superficie del sensor. Una vez ajustados satisfactoriamente ambos canales, se registró la interacción con tobramicina en solución. Se espera que, tras la introducción del antibiótico tobramicina, se produzca su reconocimiento molecular por el aptámero inmovilizado, lo que debería traducirse en un aumento de la señal SPR registrada en el canal 1.
Por el contrario, en el canal 2, donde no se ha inmovilizado ningún aptámero, la señal registrada tras la inyección de tobramicina no debería mostrar ningún cambio. Una vez conseguido el registro en esta fase (fase de asociación), se drena la solución y se introducen 50 µL de la solución reguladora libre de afinidad. Sensorgrama correspondiente a la formación del SAM mixto: SHATA+MCH (canal 1) y MCH SAM (canal 2).
Sin embargo, como se puede observar en la Figura 3.9, después de la adición de una solución de tobramicina 0,1 µM, no se observa ningún cambio de señal en ninguno de los canales.
Inmovilización de la tobramicina sobre la superficie del sensor
Unión de tobramicina (canal 1) y etanolamina (canal 2) mediante tres inyecciones sucesivas de tobramicina 10 mM en HEPES 0,1 M, pH 8,64 (el valor de pH al que la mayoría de los grupos amino presentes en la tobramicina están descargados, desde su punto isoeléctrico 8,2135 ) o etanolamina 1 M en HEPES 0,1 M pH 8,64 durante 20 minutos cada vez. El uso de esta configuración, en la que la molécula de menor peso molecular queda inmovilizada en la superficie, puede ser el origen de efectos limitantes del transporte de masa (MTL) porque el aptámero de mayor peso molecular debe difundir desde el núcleo de la solución hacia el sensor. superficie (Figura 3.12). Estas limitaciones en el transporte de masa ocurren cuando la velocidad de unión de una molécula a la superficie es mayor que su velocidad de difusión desde la solución a la superficie y afectan las fases de asociación y disociación por igual.
Cuanto mayor es la concentración de sitios de unión disponibles, mayor es el consumo de aptámero en la superficie del sensor, lo que hace más evidente el efecto de limitación del transporte de masa. Esquema de la fase de observación utilizada para realizar los ensayos de unión con SPR. Bajo las condiciones experimentales utilizadas se obtuvieron variaciones en el ángulo medido antes y después de la inmovilización de tobramicina sobre la superficie (Rtob) del canal 1 entre 15-30 mº.
Este cambio de ángulo medido se puede utilizar para calcular el recubrimiento superficial de la tobramicina inmovilizada, expresado como masa por unidad de área.
Interacción tobramicina inmovilizada-aptámero: el ciclo de
Luego de drenar la solución de la cubeta, se introducen en ella 50 µL de solución tampón y se registra durante 5 minutos la llamada fase de disociación, en la que se producirá la disolución parcial (o total) del complejo, hasta obtener una señal estable. . . Después de cada inyección, hay un rápido aumento en la señal registrada que va acompañado de un cambio en la composición de la solución en contacto con la fase de detección. Después de drenar la solución que contiene el aptámero correspondiente de la cubeta e introducir en ella la solución de afinidad, se observa una disminución en el cambio del ángulo de resonancia con el tiempo como consecuencia de la disociación del complejo de tobramicina inmovilizado del aptámero.
En el canal 1, el nivel inicial no se restablece, lo que indica que los aptámeros probados se unieron específicamente a la superficie modificada con tobramicina. En estas condiciones, los grupos amino presentes en la estructura de la tobramicina adquieren una carga positiva, de modo que se eliminan los enlaces de unión que estabilizan el complejo aptámero-tobramicina. La Figura 3.15 muestra la reproducibilidad correspondiente al registro de señal SPR inter e intrasensor.
A medida que aumenta la concentración de la solución de aptámero analizada, aumenta la pendiente del ángulo registrado (Rt) en la etapa de asociación y la señal registrada en el equilibrio (Req) (Figura 3.16).
Obtención de las constantes cinéticas y de disociación
Análisis de equilibrio
Considerando, como se mencionó anteriormente, que la señal SPR máxima, Rmax, depende de la concentración inicial disponible de tobramicina y que la señal obtenida en el equilibrio, Req, es una medida de la concentración del complejo de afinidad formado, la expresión anterior se convierte a el dado en la Ecuación 3.9. Para utilizar este modelo, los valores Req para cada una de las concentraciones de aptámero analizadas se estimaron a partir de ajustes no lineales de la fase de asociación a la Ecuación 3.6. La Figura 3.17 muestra las isotermas de Langmuir para cada uno de los aptámeros estudiados en este trabajo.
Otra forma común de calcular la constante de disociación, KD, es utilizar la representación lineal definida en la Ecuación 3.12 (Req/[aptámero]libre vs. Req). La constante de disociación, KD, se obtiene como la inversa de la pendiente de la línea obtenida al trazar los datos como se indica. Sin embargo, esta disminución no es muy grande, ya que se observó una disminución de aproximadamente 4 veces en la afinidad entre los aptámeros nativos y completamente metilados.
La introducción de la modificación 2'-OMe en el grupo 2'-OH de la base U12, que según se ha informado desempeña un papel importante en el reconocimiento molecular de la tobramicina, dio lugar a una disminución adicional de la KD de 1, 5 veces en comparación con lo observado para el aptámero donde se modificaron 26 de las 27 ribosas.
Análisis cinético
La representación del valor de ks frente a la concentración de aptámero libre, [aptámero]libre da lugar a una función lineal cuya pendiente y ordenada en el origen corresponden a los valores de ka y kd respectivamente. Una estimación más apropiada es obtener kd a partir del ajuste no lineal de la fase de disociación de cada uno de los sensogramas. En la tabla 3.3 se muestran los valores obtenidos para las constantes cinéticas y el cálculo de la constante de disociación, KD, derivada de dichos parámetros cinéticos.
Los valores de la constante de disociación, KD, se calcularon para cada uno de los tres aptámeros según la expresión KD=kd/ka. Los valores de Kd obtenidos de un ajuste no lineal a una fase de disociación donde no alcanza el valor inicial, es decir, donde la disociación es incompleta, pueden desviarse de su valor verdadero. Para evitar este efecto, kd se calculó a partir de ka.
Los valores obtenidos mediante este método alternativo son muy similares a los obtenidos mediante ajuste no lineal a la fase de disociación, lo que afecta la calidad de los datos presentados en el presente estudio.
Autoconsistencia de los resultados obtenidos y comparación con
83 mayor afinidad de unión) para el aptámero natural no modificado, ATANM, que para ATA y ATATM (mayor ka y menor kd para ATANM). La aparición de disociación incompleta puede deberse a dos causas: efectos de transporte de masa, MTL, que fueron descartados en este trabajo considerando el valor de ka como ya se explicó, o efectos de reunión. El aptámero que muestra la mayor afinidad (KD <100 nM) no está modificado, ATANM, mientras que tiene el valor de KD más alto.
En trabajos anteriores se ha evaluado la constante de afinidad del complejo formado por tobramicina y el aptámero natural antitobramicina ATANM. Rando et al., autores de la producción SELEX del aptámero anti-tobramicina, describen la interacción entre ambas moléculas con una estequiometría 1:2, dando valores respectivos de KD: KD1=9±3 nM y KD2=2,7±0,3 µM. obtenido mediante mediciones de extinción de fluorescencia en solución con tobramicina marcada (PYT) 13. La constante KD1 es notablemente inferior al valor estimado en este trabajo, hecho que posiblemente se deba a que se midió la constante de afinidad en solución y no con una de las moléculas inmovilizadas.
Esta diferencia en la constante medida puede deberse al uso de una solución reguladora diferente a la utilizada durante la selección del aptámero y por tanto no óptima, así como al uso de un aptámero marcado como elemento de reconocimiento molecular.
DESARROLLO DE UN SENSOR IMPEDIMÉTRICO PARA LA
Definición del problema analítico
- Indicaciones terapéuticas de la tobramicina
- Métodos para la determinación de tobramicina
Efecto sobre Ret de (A) tiempo de incubación de la superficie modificada con tobramicina con ATATM 0,5 µM y (B) tiempo de incubación de la fase sensor de tobramicina-ATATM con solución de tobramicina 50 µM. Curva dosis-respuesta tras la incubación de la fase sensora (tobramicina-ATATM) con diferentes concentraciones de tobramicina en solución. Curva dosis-respuesta tras la incubación de la fase sensora (tobramicina-ATATM) con diferentes concentraciones de tobramicina preparada en suero humano diluido con factor (A) 1:0,5; (B) 1:1; (C) 1:2 y (D) 1:5.
La Figura 5.2 muestra una representación esquemática de la fase de detección construida según el protocolo detallado. Por lo tanto, se realizó la optimización de la concentración de tobramicina requerida para saturar la superficie de las partículas. Representación esquemática de la fase del sensor que consiste en la unión covalente de la tobramicina a las partículas magnéticas a través del enlace amida.
Variación de la intensidad de corriente con la concentración de tobramicina utilizada para recubrir las partículas magnéticas obtenidas para [BATA]=0,5 µM y [tobramicina]=0 (gris) y [BATA]=0 µM y [tobramicina]=0 (blanco). La Figura 5.8 muestra la señal registrada para cada uno de los experimentos realizados según la trayectoria del. Variación de la relación de señal registrada para [FITC-ATA]=0,3 µM y [FITC-ATA]=0 en función de (A) el tiempo de incubación con las muestras y (B) el tiempo de incubación con la sustancia enzimática conjugada.
La espectroscopia de impedancia faradaica (FIS) como sistema de
CONCLUSIONES / CONCLUSIONS
Orientación para trabajos futuros
Reactivos, instrumentación y procedimientos
Tablas
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