UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PERÚ
FACULTAD DE INGENIERÍA QUÍMICA
EVALUACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE E. Coli Y EL TIEMPO DE CONTACTO CON NANOPARTÍCULAS DE ZnO EN
LA DESINFECCIÓN DE BACTERIAS
Tesis
Para optar el Título Profesional de Ingeniero Químico Ambiental
Presentado por:
CALDERON ESQUIVEL, ALLISSON YESELIEN ESTEBAN CONDOR, VICTOR ORLANDO
HUANCAYO - PERÚ 2022
2 TITULO
EVALUACIÓN DE LA CONCENTRACIÓN DE E. Coli Y EL TIEMPO DE CONTACTO CON NANOPARTÍCULAS
DE ZnO EN LA DESINFECCIÓN DE BACTERIAS
3 NOMBRE DEL ASESOR
MSc. EVER FLORENCIO INGARUCA ALVAREZ
4 DEDICATORIA
A Dios y a mi familia. A Dios por ser mi fuerza, mi paz y sabiduría. A mi familia, por su apoyo incondicional en las buenas y en las malas, por ser mi motivación y ganas de ser mejor Persona en lo académico y en lo personal. A ellos mis logros siempre.
VICTOR ESTEBAN
A mi abuelita por ser mi fuerza, a mi tía por ser mi compañera y en especial a mi madre por ser mi guía y mi más grande inspiración. A mi padre por su apoyo incondicional y a mi familia en el cielo que velan por mis sueños. Un paso más se ha completado.
ALLISSON CALDERON
5 AGRADECIMIENTO
Agradecemos a nuestro padre celestial, Dios por darnos el don de la fortaleza y la Perseverancia para poder lograr nuestros sueños, las infinitas gracias a nuestras familias que día a día nos impulsan a superarnos, a ser mejores, su apoyo y su cariño sobre todas las cosas. El agradecimiento también para docentes de la Facultad de Ingeniería Química, por haber compartido sus conocimientos y experiencias a lo largo de la preparación de nuestra profesión, por su paciencia, y su rectitud. Un agradecimiento especial a nuestro asesor Ing. Ever Ingaruca por ser guía, maestro y soporte en este camino de la Investigación.
6 RESUMEN
El aumento de la población en las localidades del Perú ha generado mayor demanda de agua potable por ende mayor cantidad de agua residual es generada. Por lo tanto, la desinfección es un aspecto importante y esencial de los procesos de tratamiento de aguas residuales”, los coliformes son los microorganismos patógenos mayormente encontrados en un efluente final de las PTAR entre los más representativos de esta familia tenemos al E.Coli que es un indicador de calidad de agua en el aspecto bacteriológico como se evidencia Zhang et all. (2006) y Larrea el all. (2013), En la búsqueda del uso de tecnologías que sean más eficientes en la remoción de estos microorganismos, se encontró como una alternativa, a las nanopartículas de óxido de zinc.
Se evaluó la inhibición de los microorganismos de E. Coli de aguas residuales municipales con cantidades diferentes de nanopartículas de ZnO y tiempos de contactos, para la inhibición de los microorganismos de E. Coli se utilizó soluciones acuosas de aguas residuales municipales del distrito de Sicaya. Se llevaron a cabo experimentos para la inhibición del microorganismo de E. Coli, donde las variables independientes fueron:
nanopartículas de ZnO de 10 mg a 40 mg y tiempos de contactos diferentes que varían en el rango de 0 horas a 24 horas y la variable dependiente fue la inhibición de microorganismos. Antes de iniciar el desarrollo de la parte experimental se caracterizaron las nanopartículas de ZnO, el cual se realizó mediante el análisis Dispersión de luz Dinámica, el cual determina el tamaño de las nanopartículas, presentando un diámetro medio de 22,1 nm. También se realizó una caracterización inicial de las soluciones acuosas contaminadas de la planta de tratamiento de aguas residuales (PTAR) del distrito de Sicaya, el cual presentaba 1,80E+09 UFC/100 mL dicha concentración supera los LMP establecidos por el DS N° 031-2010-SA de 0 UFC/100 mL, Se preparo agua sintetica y se realizó la inhibición de los microorganismos de E. Coli con nanopartículas de oxido de zinc a diferentes concentraciones y tiempos de contacto, mediante dos métodos el primero de distancia de inhibición y el segundo por el método de Mc Farland,
Como resultados a 10 mg de NP-ZnO no existe inhibición de los microorganismos, debido al metabolismo de las bacterias porque pueden usar iones de zinc como factor para los procesos celulares y, como resultado, no es tóxico para la bacteria E. coli, pero a una cantidad de 40 mg de NP-ZnO y con un tiempo de 24 horas se tiene la mayor inhibición del microorganismo de E. Coli de 9,00E+08 UFC/100 mL y 11,55 mm como distancia de Inhibición.
7 INTRODUCCIÓN
La investigación se centra en la inhibición de los microorganismos E. Coli con nanopartículas ZnO y variación del tiempo de contacto de las soluciones acuosas contaminadas de la planta de tratamiento de aguas residuales (PTAR) del distrito de Sicaya.
El aumento de la población en las localidades del Perú ha generado mayor demanda de agua potable por ende mayor cantidad de agua residual es generada. Las aguas residuales suelen contener altos niveles de microorganismos. Por lo tanto, la desinfección es un aspecto importante y esencial de los procesos de tratamiento de aguas residuales (Alikhani et al., 2013), las plantas de tratamientos de las EPS de la región Junín tienen muchas dificultades en disminuir la carga de E. Coli de ahora en adelante mencionados como E. Coli.
El tratamiento convencional del agua residual municipal es ineficiente debido a la remoción de materia orgánica llegan aproximadamente a un 8,2 % con respecto al Estándar de Calidad Aguas de aguas, Mileyeva-Biebesheimer et al., (2010)mencionan que los métodos tradicionales de desinfección son efectivos en el tratamiento de la mayoría de los patógenos. Pero estos métodos requieren un alto costo de capital para ser implementado en regiones en desarrollo.
Los coliformes son los microorganismos patógenos mayormente encontrados en un efluente final de las PTAR entre los más representativos de esta familia tenemos al E.
Coli que es un indicador de calidad de agua en el aspecto bacteriológico como se evidencia (Mercedes et al., 2013)
En la búsqueda del uso de tecnologías que sean más eficientes en la remoción de estos microorganismos, se encontró como una alternativa, a las nanopartículas de óxido de zinc siendo estas más eficientes en la remoción de estos patógenos y estos podrían remplazar al cloro como tratamiento terciario en las PTAR.
En vista de la problemática ambiental referente a los microorganismos se propuso desarrollar un proceso de inhibición de los microorganismos presentes en la PTAR del distrito de Sicaya mediante la agregación de nanopartículas de ZnO.
En el capítulo I se desarrolló la revisión bibliográfica que consistió en la revisión de antecedentes con respecto al tema de investigación de la inhibición de microorganismos E. Coli, también se revisó la teoría de las aguas residuales como también las nanopartículas de ZnO y por último el marco conceptual.
8 En el capítulo II se planteó la metodología a seguir en la investigación y su diseño experimental, así también los materiales, reactivo y equipos que se utilizaron en la investigación, por ultimo una explicación detalla del procedimiento a seguir en la realización del experimento.
En el capítulo III se desarrolló el tratamiento de datos y la discusión, donde se planteó los resultados obtenidos después de desarrollar las pruebas experimentales para la inhibición de los microorganismos y finalmente se hizo la discusión de nuestros resultados.
9 OBJETIVOS
Objetivo general:
Evaluar la concentración de las nanopartículas de ZnO y el tiempo de contacto en la inhibición de los microorganismos de E. Coli de aguas residuales municipales.
Objetivos específicos:
● Evaluar a qué concentración de las nanopartículas de ZnO se tiene la mayor inhibición de los microorganismos de E. Coli de las aguas residuales municipales
● Evaluar el tiempo de contacto donde se da la mayor inhibición de los microorganismos de E. Coli de las aguas residuales municipales.
10 SIMBOLOGIA UTILIZADA
EOR: Especies de oxigeno reactivas NP-ZnO: Nanopartícula de óxido de zinc NPs: Nanopartículas
SEM: Microscopio electrónico de barrido DLS: Dispersión de luz dinámica
DBCA : Diseño de bloques completamente al azar MIC : concentración inhibitoria mínima
MBC : concentración bactericida mínima
11 INDICE DE CONTENIDO
1. REVISIÓN BIBLIOGRAFICA 17
1.1. ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN: 17
1.2. MARCO TEÓRICO 21
1.2.1. Agua residual 21
A. Características Químicas: 22
B. Características Biológicas: 22
1.2.2. Aguas residuales municipales 23
1.2.3. E. coli 23
1.2.4. Nanotecnología 24
A. Nanomateriales para la desinfección del agua 25
1.2.5. Nanopartícula de Óxido de zinc 25
A. Actividad antimicrobiana 26
1.2.6. Mecanismos de desinfección de NP-ZnO 26
A. Lanzamiento de EOR (Especies de oxígeno reactivas) 27
B. Lanzamiento de Zn2+ 28
C. Contacto directo de nanopartículas con membrana celular 28
D. Diferentes mecanismos probables 28
1.2.7. Factores que afecta la actividad microbiana del NP-ZnO 30
A. Tamaño de partícula 30
B. Concentración en suspensión de NP-ZnO 31
C. Naturaleza del microorganismo 31
D. Aglomeración de nanoestructuras metálicas a lo largo del tiempo en
ensayos in vitro: 31
1.3. MARCO CONCEPTUAL 31
1.3.1. Nanopartícula 31
1.3.2. E. coli 32
1.3.3. Bacteria 32
12
1.3.4. Nanopartículas de óxido de zinc 32
1.3.5. Desinfección 32
2. PARTE EXPERIMENTAL 33
2.1. METODOLOGÍA 33
2.2. DISEÑO EXPERIMENTAL 33
2.2.1. Variables independientes 33
2.2.2. Variable dependiente 33
2.2.3. Diseño de la investigación 33
2.3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS 34
2.3.1. Materiales 34
2.3.2. Reactivos 34
2.3.3. Equipos 35
2.4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL 35
2.4.1. Evaluación de la concentración inicial de bacterias E. Coli y tiempo de contacto con nanopartículas de ZnO para la desinfección del agua 35 2.4.2. Evaluación de la concentración inicial de bacterias E. Coli que se inactivan
con nanopartículas de ZnO 36
A. Caracterización de las nanopartículas de ZnO 36
B. Procedimiento para la toma de muestras de aguas residuales 36
C. Preparación de la solución COT 37
D. Preparación de la solución salina 38
E. Preparación del agar McConkey 38
F. Activación de las E. Coli 39
G. Diluciones 40
2.4.3. Evaluación del tiempo de contacto entre las nanopartículas de ZnO con el E. Coli 41
2.4.4. Preparación del agar 45
3. TRATAMIENTO DE DATOS Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS 48
13
3.1. Resultados 48
3.2. Discusión de resultados 77
3.2.1. Evaluación de la cantidad de NP-ZnO en la inhibición de los microorganismos E. Coli 77
3.2.2. Evaluación del tiempo de contacto en la inhibición de los microorganismos E.
Coli 81
3.2.3. Evaluación de la cantidad de NP-ZnO y tiempo de contacto en la inhibición
de los microorganismos E. Coli 85
3.3. Contrastación de hipótesis 89
14 ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1 Composición típica de las aguas residuales domésticas sin tratar ... 23 Tabla 2 Niveles máximos y mínimos de las variables independientes... 33 Tabla 3 Proporción de caldo Muller Hilton y solución tamponada para la solución COT ... 37 Tabla 4: Diámetro del halo de inhibición en el bloque 1 y bloque 2 para NP-ZnO a 10 mg ... 49 Tabla 5: Diámetro del halo de inhibición en el Bloque 1, bloque 2, bloque 3 y bloque 4 con 20 mg/L de NP-ZnO ... 50 Tabla 6: Diámetro del halo de inhibición en el bloque 1, bloque 2, bloque 3 y bloque 4 para NP-ZnO a 40 mg ... 52 Tabla 7: Escala de Mc Farland ... 53 Tabla 8: Inhibición de microorganismos en el bloque 1 para NP-ZnO a 10 mg ... 53 Tabla 9: Inhibición de microorganismos en el bloque 1, bloque 2, bloque 3 y bloque 4 para NP-ZnO a 20 mg ... 55 Tabla 10: Inhibición de microorganismos en el bloque 1, bloque 2, bloque 3 y bloque 4 para NP-ZnO a 40 mg ... 57 Tabla 11: Diámetro del halo de inhibición en el bloque 1 y bloque 2 para un tiempo de contacto total de 24 horas ... 59 Tabla 12: Inhibición de microorganismos en el bloque 1 y bloque 2 en función al tiempo de contacto para NP-ZnO a 10 mg ... 65 Tabla 13: Tiempo de contacto y NP-ZnO a 20 mg por el método de distancia de inhibición ... 85 Tabla 14: Tiempo de contacto y NP-ZnO a 40 mg por el método de distancia de inhibición ... 86 Tabla 15: Tiempo de contacto y NP-ZnO a 20 mg por el método de Mc Farland ... 86 Tabla 16: Tiempo de contacto y NP-ZnO a 40 mg por el método de Mc Farland ... 87 Tabla 17: Análisis de varianza para el método de distancia de inhibición a 20 mg de NP- ZnO ... 89 Tabla 18: Análisis de varianza para el método de distancia de inhibición a 40 mg de NP- ZnO ... 90 Tabla 19: Análisis de varianza para el método de Mc Farland a 20 mg de NP-ZnO ... 91 Tabla 20: Análisis de varianza para el método de Mc Farland a 40 mg de NP-ZnO ... 93
15 ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1: E. coli en cultivo de crecimiento logarítmico ... 24
Figura 2: Diferentes mecanismos posibles de la actividad antibacteriana de NP-ZnO .. 27
Figura 3: Internacionalización de nanopartícula en la célula ... 29
Figura 4: Mecanismos hipotéticos de la actividad antibacteriana de ZnO en el E. coli . 30 Figura 5: Disposición del pellet de bacteria en la solución COT ... 39
Figura 6: Esquema de las diluciones ... 41
Figura 7: Esquema de las diluciones después de agregar la solución de ZnO ... 45
Figura 8: Tamaño de las nanopartículas de ZnO ... 48
Figura 9: Tiempo de contacto vs el diámetro de inhibición en el bloque 1 con 20 mg de NP-ZnO ... 60
Figura 10: Tiempo de contacto vs el diámetro de inhibición en el bloque 2 con 20 mg de NP-ZnO ... 60
Figura 11: Tiempo de contacto vs el diámetro de inhibición en el bloque 3 con 20 mg de NP-ZnO ... 61
Figura 12: Tiempo de contacto vs el diámetro de inhibición en el bloque 4 con 20 mg de NP-ZnO ... 62
Figura 13: Tiempo de contacto vs el diámetro de inhibición en el bloque 1 con 40 mg de NP-ZnO ... 62
Figura 14: Tiempo de contacto vs el diámetro de inhibición en el bloque 2 con 40 mg de NP-ZnO ... 63
Figura 15: Tiempo de contacto vs el diámetro de inhibición en el bloque 3 con 40 mg de NP-ZnO ... 64
Figura 16: Tiempo de contacto vs el diámetro de inhibición en el bloque 4 con 40 mg de NP-ZnO ... 64
Figura 17: Tiempo de contacto vs el diámetro de inhibición en el bloque 1 con 20 mg de NP-ZnO ... 66
Figura 18: Tiempo de contacto vs el diámetro de inhibición en el bloque 2 con 20 mg de NP-ZnO ... 67
Figura 19: Tiempo de contacto vs el diámetro de inhibición en el bloque 3 con 20 mg de NP-ZnO ... 68
16 Figura 20: Tiempo de contacto vs el diámetro de inhibición en el bloque 4 con 20 mg de
NP-ZnO ... 68
Figura 21: Tiempo de contacto vs el diámetro de inhibición en el bloque 1 con 40 mg de NP-ZnO ... 69
Figura 22: Tiempo de contacto vs el diámetro de inhibición en el bloque 2 con 40 mg de NP-ZnO ... 70
Figura 23: Tiempo de contacto vs el diámetro de inhibición en el bloque 3 con 40 mg de NP-ZnO ... 71
Figura 24: Tiempo de contacto vs el diámetro de inhibición en el bloque 4 con 40 mg de NP-ZnO ... 71
Figura 25: Tiempo de contacto vs NP-ZnO (20 mg) ... 73
Figura 26: Tiempo de contacto vs NP-ZnO (40 mg) ... 74
Figura 27:Tiempo de contacto vs NP-ZnO (20 mg) Mc Farland ... 75
Figura 28: Tiempo de contacto vs NP-ZnO (40 mg) Mc Farland ... 76
Figura 29: NP-ZnO (20 mg) método de distancia de inhibición ... 77
Figura 30: NP-ZnO (40 mg) método de distancia de inhibición ... 78
Figura 31: NP-ZnO (20 mg) método de Mc Farland ... 79
Figura 32: NP-ZnO (40 mg) método de Mc Farland ... 79
Figura 33: Tiempo de contacto por el método de distancia de inhibición ... 81
Figura 34: Tiempo de contacto por el método de distancia de inhibición ... 82
Figura 35: Tiempo de contacto con el método de Mc Farland ... 83
Figura 36: Tiempo de contacto con el método de Mc Farland ... 83
Figura 37: Grafica de probabilidad normal para los 20 mg de NP-ZnO del método de distancia de inhibición ... 90
Figura 38: Grafica de probabilidad normal para los 40 mg de NP-ZnO del método de distancia de inhibición ... 91
Figura 39: Grafica de probabilidad normal para los 20 mg de NP-ZnO del método de Mc Farland. ... 92
Figura 40: Grafica de probabilidad normal para los 40 mg de NP-ZnO del método de Mc Farland. ... 93
17 CAPÍTULO I
1. REVISIÓN BIBLIOGRAFICA
1.1. ANTECEDENTES DE LA INVESTIGACIÓN:
En la investigación de Alikhani et al., (2013) desarrollaron la eliminación fotocatalítica efectiva de bacterias Gram negativas E. Coli de una solución acuosa mediante el uso de nanopartículas de ZnO bajo irradiación con luz ultravioleta; investigaron el efecto de varios parámetros, como el pH de la solución, la dosis de ZnO, el tiempo de contacto y la concentración inicial de E. coli; la máxima desinfección fotocatalítica fue a pH neutro debido a la actividad fotocatalítica reducida de ZnO a valores de pH bajos y altos originados por corrosión ácida/fotoquímica del catalizador y/o pasivación superficial con Zn(OH)2; a medida que aumentó la dosis de ZnO, la desaparición fotocatalítica de E. coli aumentó continuamente, pero disminuyó gradualmente por encima de 2 g/L de ZnO debido al mayor bloqueo de la luz UV incidente utilizada, determinaron 1 g/L como la dosis óptima de ZnO; la eliminación fotocatalítica de E. coli disminuyó a medida que aumentó la concentración inicial de E. coli, utilizaron tres modelos cinéticos (ecuaciones de cero, primer y segundo orden) para correlacionar los datos experimentales y determinar los parámetros cinéticos.
Zarrindokht y Chehrazi, (2012)determinaron la actividad antimicrobiana de las nanopartículas de ZnO contra bacterias Gram-negativas y Gram-positivas;
utilizaron Escherichia coli (E. coli) y Staphylococcus aureus (S. aureus) como microorganismos de prueba; estudiaron los efectos del tamaño de partícula y la concentración en la actividad antibacteriana de las nanopartículas de ZnO mediante pruebas bacteriológicas como métodos de agar de difusión por disco y pozo, concentración inhibitoria mínima (MIC) y concentración bactericida mínima (MBC), midieron el efecto de diferentes concentraciones de nanopartículas de ZnO sobre el crecimiento de E. coli y S. aureus con respecto al tiempo, determinaron la concentración inhibitoria mínima utilizando seis concentraciones diferentes de nanopartículas de ZnO cuyos valores estuvieron entre 0,5 a 16 mg/mL; el valor de MIC para E. coli y S. aureus fue de 1 mg/mL y 0,5 mg/mL, respectivamente; los resultados mostraron que las
18 nanopartículas de ZnO tuvieron una zona de inhibición antibacteriana de 29 mm y 19 mm a una concentración de 10 mg/mL contra E. coli y S. aureus, respectivamente, descubrieron que la actividad antibacteriana de las nanopartículas de ZnO aumentó al disminuir el tamaño de las partículas y al aumentar la concentración de polvo.
Hrenovic, Milenkovic, Daneu, Kepcija, y Rajic, (2012) investigó la actividad antimicrobiana de las nanopartículas de Cu2O, ZnO y NiO soportadas sobre clinoptilolita natural en el efluente secundario en condiciones oscuras, después de 24 h de contacto, las nanopartículas de Cu2O y ZnO redujeron el número de células bacterianas viables de E. Coli y Staphylococcus aureus en cultivo puro durante cuatro a seis órdenes de magnitud y mostraron un 100 % constante de actividad antibacteriana contra E. coli nativa después de 1 h de contacto durante 48 exposiciones, las nanopartículas de Cu2O y NiO mostraron 100 % de actividad antiprotozoaria contra Paramecium caudatum y Euplotes affinis después de 1 h de contacto, mientras que las nanopartículas de ZnO fueron menos eficientes, la morfología y la cristalinidad de las nanopartículas no fueron afectadas por microorganismos.
En la investigación de You, Zhang, y Hu, (2011) estudiaron el efecto de dos nanopartículas de uso común, nanopartículas de plata (AgNP, tamaño de partícula promedio = 21 nm) y nanopartículas de óxido de zinc (ZnONP, tamaño de partícula promedio = 39 nm), sobre el crecimiento de bacterias (E.
Coli) y los bacteriófagos (MS2) se evaluaron utilizando un método estándar de doble capa de agar (DAL) y un ensayo de microtitulación turbidimétrico.
Una exposición previa de 1 h de MS2 a nanopartículas no inactivó MS2 a las concentraciones de nanopartículas más altas probadas (5 mg/L de Ag total y 20 mg/L de ZnO), no observaron inactivación bacteriófaga en presencia de AgNPs, Ag+/AgNPs (50:50 en relación de masa) o iones Ag+, todos a la concentración total de Ag de 5 mg/L, en un sistema binario (bacterias-fagos) donde el huésped E. coli estuvo expuesto a MS2 y nanopartículas simultáneamente, los cambios dinámicos de bacterias activas y fagos MS2 durante la incubación demostraron que la exposición de AgNP (5 mg/L Ag) y ZnONP ( 20 mg/L ZnO) aumentó el número de fagos en 2–6 órdenes de
19 magnitud, estos resultados sugirieron que la exposición de nanopartículas podría facilitar en gran medida los virus bacterianos como MS2 para infectar al huésped E. coli.
En el trabajo de investigación de Carbone, Briancesco, y Bonadonna, (2017) estudiaron la viabilidad contra E. coli probando el poder antimicrobiano de un óxido mixto de Cu/Zn, realizaron una síntesis fácil y respetuosa con el medio ambiente de nanopartículas de CuO, ZnO y Cu0,73Zn0,27O a través de precursores de hidroxicarbonato, las muestras se caracterizaron por varias técnicas, probaron la eficacia antimicrobiana de las nanopartículas por dos ensayos de inhibición de crecimiento independiente, los métodos de cultivo y la densidad óptica después del tiempo de contacto 4 a 24 h y muestra una dependencia tanto del tiempo como de la concentración, el óxido mixto de Cu0,73Zn0,27O exhibe la mayor actividad antimicrobiana, con una inhibición del crecimiento del 90 % ya después de 8 h para una dosis de 200 μg/mL, mientras que CuO alcanza el mismo rendimiento solo después de 24 h y ZnO tiene, comparativamente, solo un actividad limitada.
Mostafaii, Chimehi, Gilasi, y Iranshahi, (2017) investigaron los efectos de las nanopartículas de óxido de zinc en la eliminación de bacterias coliformes totales del efluente del proceso de lodos activados de las aguas residuales municipales, después del cultivo de las muestras por el método de fermentación de múltiples tubos, la tasa de coliformes totales se evaluó mediante la tabla MPN, los resultados mostraron que las nanopartículas de ZnO podían eliminar el 100 % del coliformes totales en el efluente de lodo activado municipal en una concentración de 1,1 g/L en 90 minutos de tiempo de contacto, además, el porcentaje total de remoción de coliformes mostró una diferencia significativa en 20 minutos con la de 40 minutos, 60 minutos y 90 minutos, no observaron una relación significativa en la concentración de nanopartículas de ZnO con la eficiencia de eliminación.
Huang et al., (2018) investigó la reducción de E. coli usando un disco de agua de cerámica recubierto con nano ZnO, el recubrimiento de nano ZnO condujo al cambio de la superficie del filtro de disco, la reducción de E. coli se atribuyó
20 tanto a la retención del filtro como a la actividad antibacteriana fotocatalítica del nano ZnO, estudiaron los efectos de la concentración inicial de E. coli, variando las concentraciones desde 10 UFC/mL a 107 UFC/mL, observaron que con el aumento de la concentración inicial de E. coli en el afluente, la concentración de E. coli en el efluente también aumentó; el tiempo de iluminación, variándolo entre 20 minutos, 40 minutos y 60 minutos y la potencia de la lámpara, estudiando potencias de 9 a 20 W, sobre la efectividad de eliminación de E. coli, las concentraciones de E. coli, lograron disminuir la concentración de E. coli hasta 3UFC/mL.
En el estudio de Zhang, Chen, Xie, y Li, (2012) investigaron las actividades antimicrobianas de ZnO contra las cepas de bacterias Gram-positivas y Gram- negativas: E. coli y pseudomicosis sarcínica, utilizaron curvas de crecimiento de cepas de bacterias para estimar las actividades antimicrobianas de las suspensiones de ZnO, los resultados indicaron que con la presencia de 0,05 g/L de ZnO, la suspensión de ZnO mostró las actividades antimicrobianas contra ambas cepas de bacterias, sin importar que se presentaran 0,5 mL, 0,05 mL o 0,005 mL de suspensión de bacterias, cuando se usó el tratamiento con suspensión de ZnO para tratar una alta concentración de suspensión de bacterias, el número de bacterias aumentó después de 8 horas, esto sugirió que la suspensión de ZnO exhibía acción inhibidora, cuando se trata con una baja concentración de suspensión de bacterias, la suspensión de ZnO mostró una acción mortal.
Hoseinzadeh, Alikhani, Samarghandi, y Shirzad-Siboni, (2014) estudiaron el potencial antimicrobiano de nanopartículas de óxido de zinc sintetizado (ZnO) contra cuatro cepas de bacterias (E. Coli ATCC 25922 y Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, como bacterias gram negativas, Staphylococcus epidermidis PTCC 1114 y Staphylococcus aureus ATCC 25923 como bacterias grampositivas); en primer lugar prepararon las nanopartículas de ZnO por el método químico con un inhibidor químico orgánico, a partir del análisis de imágenes SEM (microscopio electrónico de barrido), encontraron que el tamaño medio de partícula fue de 50 nm, además, el área de superficie media se determinó como 90 m2/g mediante análisis Brauner – Emmet – Teller
21 (BET), estudiaron el ensayo antibacteriano, la concentración inhibitoria mínima (MIC), la concentración bactericida mínima (MBC) y el método de difusión en disco y se realizaron estudios de tiempo muerto, los estudios de difusión en disco revelaron una mayor efectividad para P. aeroginosa; los MIC y sus resultados mostraron que la eficiencia de las partículas aumenta con el aumento de la dosis de partículas en suspensión y el tiempo de tratamiento; a partir de este trabajo, sugirieron que las nanopartículas de ZnO son excelentes agentes antibacterianos.
En el trabajo de investigación de Mileyeva-Biebesheimer, Zaky, y Gruden, (2010) determinaron si las nanopartículas de óxido metálico (NP) dañaron las membranas celulares bacterianas, la integridad de la membrana celular bacteriana se determinó después de 1 h de exposición a dióxido de titanio (TiO2) y NP de óxido de zinc (ZnO) (0 mg/L, 10 mg/L, 50 mg/L, 100 mg/L y 500 mg/L) en agua ultrapura y en presencia de materia orgánica natural, los resultados revelaron un impacto medible en la integridad de la membrana celular de las bacterias Gram-negativas (E. Coli) a 100 mg/L y 500 mg/L de TiO2, incluso en presencia de materia orgánica natural (2 mg/L de carbono orgánico disuelto), por otro lado, no se observó ningún cambio en la integridad de la membrana celular con ZnO que se agrega y precipita a concentraciones iguales o superiores a 100 mg/L, además, las bacterias Gram-positivas (Enterococcus faecium) no se vieron afectadas en presencia de ZnO o TiO2
Esta interacción no se observó para NP-ZnO o células Gram-positivas.
1.2. MARCO TEÓRICO 1.2.1. Agua residual
El agua residual se define como cualquier agua que ha sido afectada negativamente en calidad por los humanos y es una mezcla compleja de materiales inorgánicos y orgánicos. Las aguas residuales son aguas usadas de cualquier combinación de actividades domésticas, industriales, comerciales o agrícolas, escorrentía superficial o aguas pluviales, y cualquier entrada o infiltración de alcantarillas (Hussain, Athar, y Ayushman, 2019).
Las aguas residuales contienen aproximadamente 99,9 % de agua, los demás está constituido por materia orgánica e inorgánica, solidos disueltos y
22 suspendidos junto con microrganismos, es por este 0,1 % que el agua residual necesita ser tratada (Von Sperling, 2008).
A. Características Químicas:
Las principales características del agua residual incluyen (Alzboon, Hung, y Radaideh, 2012):
● Materia orgánica: carbono orgánico total (TOC) B. Características Biológicas:
En términos de tratamiento de aguas residuales, los microorganismos más importantes en el tratamiento biológico son las bacterias, algas, hongos, protozoos y rotíferos. Se puede esperar que el recuento de bacterias en las aguas residuales de aguas crudas oscila entre 5x105 UFC/mL-5x106 UFC/mL. La prueba más básica para la contaminación bacteriana es la prueba de bacterias coliformes totales (Alzboon et al., 2012).
Los coliformes totales incluyen bacterias que se encuentran en el suelo, en el agua que ha sido influenciada por el agua superficial y en los desechos humanos o animales. Los coliformes fecales son el subgrupo de los coliformes totales que se consideran específicamente presentes en el intestino y heces de animales de sangre caliente. Debido a que los orígenes de los coliformes fecales son más específicos que los orígenes del grupo de bacterias coliformes totales más generales, los coliformes fecales se consideran una indicación más precisa de desechos animales o humanos que los coliformes totales. Los recuentos promedio de coliformes totales y coliformes fecales en aguas residuales oscilan entre 108 UFC/100 ml -1012 UFC/100 ml respectivamente. En términos de requerimiento de oxígeno, las bacterias se clasifican en aerobias, anaerobias o facultativas. La mayoría de las bacterias no pueden tolerar niveles de pH superiores a 9,5 o inferiores a 4, por lo que las aguas residuales municipales se consideran una condición ambiental adecuada para su crecimiento. Los hongos tienen la capacidad de crecer con bajo contenido de humedad, baja fuente de nitrógeno y tolerar a un amplio rango de pH (2-9) (Alzboon et al., 2012).
23 Hay varias variables que influyen en el crecimiento bacteriano, pero se han mantenido constantes para no afectar los resultados.
1.2.2. Aguas residuales municipales
Las aguas residuales domésticas son principalmente una combinación de heces humanas, orina y aguas grises. Las aguas grises resultan del lavado, el baño y la preparación de comidas. El agua de diversas industrias y negocios también puede ingresar al sistema. Las personas excretan de 100 g a 500 g de peso húmedo de heces y de 1 L a 1,3 L de orina por persona al día. La expresión de la materia orgánica se presenta en la Tabla 1 (Gerba y Pepper, 2015).
Tabla 1 Composición típica de las aguas residuales domésticas sin tratar
concentración
Contaminantes Baja moderada alto
Carbono orgánico total 80 160 290
Fuente: (Gerba & Pepper, 2015)
La cantidad de materia orgánica en los desechos domésticos determina el grado de tratamiento biológico requerido. Se utilizan tres pruebas para evaluar la cantidad de materia orgánica: demanda bioquímica de oxígeno (DBO), demanda química de oxígeno (DQO) y carbono orgánico total (COT).
1.2.3. E. coli
Los estudios de caracterización de heces humanas y animales muestran que E.
coli representa más del 94 % de los coliformes termotolerantes aislados directamente de las heces humanas, mientras que los otros coliformes termotolerantes oscilan entre 3,2 % y 7,4 % (Tallon, Magajna, Lofranco, y Leung, 2005).
E. coli es miembro de la familia Enterobacteriaceae, es una bacteria Gram negativa, anaerobia facultativa, comúnmente coloniza el tracto gastrointestinal de humanos y animales de sangre caliente. Al ser un microbio intestinal, E. coli puede ser defecada; por lo tanto, se transmite principalmente al medio ambiente a través de las heces, como parte de la flora intestinal normal, la mayoría de las cepas de E. coli permanecen inofensivas; sin
24 embargo, también hay cepas patógenas asociadas con enfermedades humanas y animales (Paruch y Mæhlum, 2012).
Esta bacteria posee la enzima ß-Dglucuronidasa capaz de degradar el sustrato 4-metilumberiferil-ß-D-glucurónico (MUG), formando 4- metilumbeliferona, además son capaces de producir indol a partir de triptófano y posee la enzima ß-D-galactosidasa (GAL), que reacciona positivamente en el ensayo del rojo de metilo y pueden descarboxilar el ácido L-glutámico, pero no son capaces de utilizar citrato como única fuente de carbono o de crecer en un caldo con cianuro de potasio (Mercedes, Larrea-murrell, Rojas-badía, Romeu-álvarez, y Heydrich- pérez, 2013).
Figura 1: E. coli en cultivo de crecimiento logarítmico
Fuente: (Tallon et al., 2005)
1.2.4. Nanotecnología
Se considera que la nanotecnología ambiental desempeña un papel clave en la configuración de la ingeniería y la ciencia ambiental actual. La nanoescala ha estimulado el desarrollo y el uso de tecnologías novales y rentables para la remediación, detección de contaminación, monitoreo de contaminación y remediación de contaminantes. Los materiales nanoestructurados se utilizan como biosensores para el monitoreo y la detección de diferentes compuestos.
El uso de nanoparticulas puede tener ventaja sobre el método convencional debido a la superficie mucho mayor de nanopartículas en masa (Pandey y Fulekar, 2012).
Para la remediación ambiental, los metales a nanoescala y los óxidos metálicos más ampliamente estudiados incluyen plata, hierro, oro, zinc, óxidos de hierro, óxidos de titanio, etc. El tamaño y la forma de los NM y NMO son factores
25 importantes que afectan su rendimiento (Khin, Nair, Babu, Murugan, y Ramakrishna, 2012).
A. Nanomateriales para la desinfección del agua
Aunque una multitud de contaminantes del agua representan amenazas para la salud, la mayor amenaza transmitida por el agua proviene de bacterias, virus y hongos patógenos. Las soluciones tradicionales para la desinfección del agua, como la cloración y la ozonización, se enfrentan a crecientes barreras y complejidades. Producen DBP cancerígeno, como trihalometanos, halomidas, halonitrilos y bromato, y se han vuelto cada vez menos eficaces para tratar un número creciente de microorganismos resistentes. A diferencia de los desinfectantes tradicionales, los nanomateriales no son oxidantes fuertes y, por lo tanto, no producen DBP dañino y tienen el potencial de mejorar los métodos de tratamiento convencionales (Li et al., 2008).
La nanotecnología tiene el potencial de avanzar en el tratamiento de agua y aguas residuales al mejorar la eficiencia del tratamiento. Hay varias clases de nanomateriales que se están evaluando como materiales para la purificación del agua que tienen una amplia gama de propiedades fisicoquímicas que los hacen atractivos para la purificación del agua. Los nanomateriales pueden atacar las células microbianas a través de diversos mecanismos antimicrobianos. Los nanomateriales antimicrobianos inorgánicos más comunes son AgNP, TiO2 y ZnO, estos se utilizan en una amplia variedad de aplicaciones de control microbiano, como la desinfección de dispositivos médicos y electrodomésticos, y el tratamiento del agua (Li et al., 2008).
1.2.5. Nanopartícula de Óxido de zinc
El ZnO se describe como un material inorgánico funcional, estratégico, prometedor y versátil con una amplia gama de aplicaciones, posee propiedades ópticas, de detección química, semiconductoras, de conductividad eléctrica y piezoeléctricas, aunque ZnO muestra un carácter covalente ligero, tiene un enlace iónico muy fuerte en el Zn-O. Su mayor durabilidad, mayor selectividad y resistencia al calor están precedidas que los materiales orgánicos e inorgánicos. La síntesis de ZnO de tamaño nanométrico
26 ha llevado a la investigación de su uso como nuevo agente antibacteriano.
Además de sus propiedades antibacterianas y antifúngicas únicas, los NP-ZnO poseen altas actividades catalíticas y fotoquímicas. ZnO posee una alta absorción óptica en las regiones UVA (315 mm – 400 nm) y UVB (280 nm – 315 nm), que es una respuesta beneficiosa antibacteriana y se utiliza como protector UV en cosméticos (Sirelkhatim et al., 2015).
A. Actividad antimicrobiana
La actividad antimicrobiana es la acción por la cual se inhibe o destruye el crecimiento microbiano. Se ha descubierto que ZnO tiene potentes propiedades antimicrobianas entre los diversos óxidos metálicos.
Además, el ZnO es estable en condiciones de procesamiento severas, lo que lo hace adecuado para aplicaciones antimicrobianas (Dimapilis, Hsu, Mendoza, y Lu, 2018).
Las bacterias generalmente se caracterizan por una membrana celular, pared celular y citoplasma. La pared celular se encuentra fuera de la membrana celular y está compuesta principalmente por una capa homogénea de peptidoglucano (que consiste en aminoácidos y azúcares). Las bacterias grampositivas tienen una membrana citoplasmática con múltiples capas de polímero de peptidoglucano y una pared celular más gruesa (20 nm–80 nm). Mientras que la pared de bacterias gramnegativas está compuesta por dos membranas celulares, una membrana externa y una membrana plasmática con una capa delgada de peptidoglicano con un espesor de 7nm–8 nm. El tamaño de las nanopartículas dentro de estos rangos puede pasar fácilmente a través del peptidoglucano y, por lo tanto, es altamente susceptible al daño (Sirelkhatim et al., 2015).
1.2.6. Mecanismos de desinfección de NP-ZnO
La actividad antibacteriana de los NP-ZnO se ha referido a una serie de problemas, pero el mecanismo exacto de toxicidad no está completamente iluminado y sigue siendo controvertido, ya que hay algunas consultas dentro del espectro de la actividad antibacteriana que requieren explicaciones profundas. Los mecanismos distintivos que se han presentado en la literatura se enumeran de la siguiente manera: contacto directo de NP-ZnOs con las
27 paredes celulares, lo que resulta en la destrucción de la integridad celular bacteriana, la liberación de iones antimicrobianos principalmente Zn2+ y formación de EOR, sin embargo, el mecanismo de toxicidad varía en varios medios ya que las especies de Zn disuelto pueden cambiar de acuerdo con los componentes del medio además de las propiedades fisicoquímicas de los NP- ZnO (Dimapilis et al., 2018).
Figura 2: Diferentes mecanismos posibles de la actividad antibacteriana de NP-ZnO Fuente: (Sirelkhatim et al., 2015)
A. Lanzamiento de EOR (Especies de oxígeno reactivas)
La actividad antimicrobiana de las nanopartículas de ZnO implica la liberación de especies de oxígeno de la superficie de ZnO que causan daños fatales a los microorganismos. Se sabe que los EOR causan estrés oxidativo al dañar el ADN, las membranas celulares y las proteínas celulares. La ruptura de la pared celular se debe a la actividad superficial de ZnO que causa la descomposición de la pared celular y, posteriormente, de la membrana celular, la fuga del contenido celular y, finalmente, la muerte celular. El mecanismo fue presentado de la siguiente manera (Dimapilis et al., 2018):
El ZnO se activa mediante luz UV y visible para formar pares de electrones:
ZnO + hv → e- + h +
28 Los pares de electrones dividen las moléculas de agua de la suspensión de ZnO en •OH y H+:
h+ + H2O →•OH + H+ Moléculas de O2 producen anión superóxido:
e¯ + O2 →•O2¯
El anión superóxido reacciona con H+ para generar HO2• radicales:
•O2¯ + H+ → HO2•
HO2• interfiere con los electrones que generan aniones de peróxido de hidrógeno que reaccionan con H+ y producen moléculas de peróxido de hidrógeno:
HO2•
+ H+ + e¯ → H2O2
El peróxido de hidrógeno puede penetrar la membrana celular y matar las bacterias (Sirelkhatim et al., 2015).
B. Lanzamiento de Zn2+
Otro posible mecanismo para la actividad antibacteriana de ZnO es la liberación de iones Zn2+ que pueden dañar la membrana celular y penetrar el contenido intracelular, el Zn2+ lanzado tiene un efecto significativo en la inhibición del transporte activo, así como en el metabolismo de los aminoácidos y la alteración del sistema enzimático.
(Sirelkhatim et al., 2015).
C. Contacto directo de nanopartículas con membrana celular
El daño celular no necesariamente resulta de la entrada de las partículas de óxido metálico en la célula. Más importante es el contacto entre la célula bacteriana y la partícula que causa cambios en el microambiente dentro del área de contacto del organismo y la partícula, después del contacto con nanopartículas de ZnO, las paredes celulares bacterianas se dañaron y desorganizaron. El ZnO abrasivo causó una mayor permeabilidad de la membrana que condujo a la posterior internalización celular de las nanopartículas (Sirelkhatim et al., 2015).
D. Diferentes mecanismos probables
Otras sugerencias para el logro del bactericida son la inhibición del metabolismo energético, una vez que las nanopartículas han internalizado las bacterias. Los NP-ZnO son bactericidas y, por lo tanto,
29 alteran la membrana y causan disfunción de la membrana, lo que resulta en su internalización en la bacteria (Fig. 3). La internalización de ZnO está controlada por el tamaño de partícula, la química de la superficie, los defectos y la funcionalización de la nanopartícula (Sirelkhatim et al., 2015).
Figura 3: Internacionalización de nanopartícula en la célula Fuente: (Sirelkhatim et al., 2015)
Entre otros mecanismos se da la interacción electrostática entre NPs y la superficie celular de las bacterias como causa de inhibición del crecimiento, y que la carga bacteriana total es negativa, debido a la formación excesiva de grupos carboxilo separado, por lo tanto, la superficie celular está cargada negativamente, curiosamente, los NP- ZnO contienen una carga positiva en una suspensión de agua, tales cargas inversas mejoran el efecto total al crear fuerzas electrostáticas, que sirven como un poderoso enlace entre los NP y la superficie bacteriana. Como resultado, la membrana celular está dañada. Además, un hallazgo idéntico mostró la unión de NP-ZnOs a la pared celular externa y el paso en la pared interna, causando la interrupción de la membrana y el consiguiente trastorno y fuga (Gutiérrez, Plessing, y García, 2011).
La acción de NP-ZnOs tiene una textura superficial abrasiva que influye en el mecanismo antibacteriano, que en secuencia destruye la membrana bacteriana. La propiedad abrasiva de ZnO ha sido reconocida y referida a sus defectos superficiales. Estos defectos como esquinas, bordes y defectos químicos tienen un impacto importante en la actividad antibacteriana en el daño mecánico en la pared celular; la
30 actividad antibacteriana de nanoestructuras de ZnO es un defecto dependiente de la superficie que, en secuencia, depende de la forma.
Aunque el mecanismo detallado de la actividad antibacteriana de ZnO está en discusión, los tres mecanismos hipotéticos más ampliamente aceptados e informados en la literatura son (Gutiérrez et al., 2011):
● Captación de iones metálicos (translocación e internalización de partículas) en las células, seguido del agotamiento del ATP intracelular producción e interrupción de la replicación del ADN.
● Generación de EOR a partir de óxidos metálicos e iones de NP con daño oxidativo posterior a las estructuras celulares.
● Cambios en la permeabilidad de la membrana bacteriana (liberación progresiva de lipopolisacáridos, proteínas de membrana, y factores intracelulares) y la disipación de la fuerza motriz del protón como resultado de la acumulación y disolución de NP en la membrana.
Estos mecanismos se ilustraron en la figura 4.
Figura 4: Mecanismos hipotéticos de la actividad antibacteriana de ZnO en el E. coli Fuente: (Gutiérrez et al., 2011)
1.2.7. Factores que afecta la actividad microbiana del NP-ZnO A. Tamaño de partícula
La disminución del tamaño de partícula aumenta la actividad antimicrobiana de ZnO. Esto se atribuye a la mayor relación
31 superficie/volumen que resulta en un medio más eficiente para la actividad antibacteriana (Sirelkhatim et al., 2015).
B. Concentración en suspensión de NP-ZnO
Diversas investigaciones han informado un aumento en la actividad antimicrobiana con un aumento en la concentración de ZnO. Sin embargo, hubo diferencias en las concentraciones mínimas de actividad antimicrobiana que pueden deberse a diferencias en las pruebas antimicrobianas y los microorganismos utilizados (Dimapilis et al., 2018).
C. Naturaleza del microorganismo
Existen diferencias en la naturaleza de los microorganismos que pueden afectar su respuesta a la toxicidad del ZnO. En algunos estudios se encuentra que la acción antibacteriana de ZnO, que se sabe que ocurre a través de su interacción con compuestos de células bacterianas, aumenta más en bacterias Gram positivas que en Gramnegativas, las bacterias grampositivas son más susceptibles al ZnO debido a su estructura de membrana celular más simple (Dimapilis et al., 2018).
D. Aglomeración de nanoestructuras metálicas a lo largo del tiempo en ensayos in vitro:
La aglomeración puede afectar el resultado y la interpretación de los resultados de la actividad antibacteriana. Las nanopartículas dispersas o débilmente agregadas en suspensión tienen una estructura interna más distorsionada, diferente reactividad y tasas de reacciones superficiales que las nanopartículas fuertemente agregadas. Tales cambios en las propiedades fisicoquímicas pueden alterar la interacción de las nanopartículas con las bacterias y la eficiencia bactericida (Gutiérrez et al., 2011).
1.3. MARCO CONCEPTUAL 1.3.1. Nanopartícula
Partículas dispersiones o partículas sólidas con un tamaño en el rango de 10 nm -1000 nm (Paruch y Mæhlum, 2012).
32 1.3.2. E. coli
Escherichia coli: Bacteria principal dentro del grupo TCB, estando presente en grandes cantidades en las heces a concentraciones de 109 por gramo de materia fecal. Como parte de la flora intestinal normal, la mayoría de las cepas de E. coli permanecen inofensivas. Sin embargo, también hay cepas patógenas asociadas con enfermedades humanas y animales (Paruch y Mæhlum, 2012).
1.3.3. Bacteria
Grupo de organismos procariotas y son organismos microscópicos unicelulares con varias formas: esféricas, varillas, espirales y formas de coma (Parker, 2001).
1.3.4. Nanopartículas de óxido de zinc
Polvos blancos y se usan comúnmente en las industrias de protección solar y alimentos. Los NP-ZnO pueden usarse como agentes antimicrobianos preferidos sobre NP-Ag debido a su bajo costo, baja toxicidad y propiedades de barrera ultravioleta. Las nanopartículas de óxido de zinc generalmente se sintetizan mediante procesos mecanoquímicos y pueden prepararse mediante procesos sol-gel y pirólisis por pulverización (Jaiswal, Shankar, y Rhim, 2019).
1.3.5. Desinfección
Es un proceso diseñado para matar microorganismos microbianos vegetativos y de crecimiento activo hasta cierto nivel, y no se aplica, a menos que el desinfectante se clasifique como esterilizante, a las endosporas bacterianas (Sandle, 2016)
33 CAPÍTULO II
2. PARTE EXPERIMENTAL 2.1. METODOLOGÍA
Se realizó una metodología experimental donde se manipuló las variables independientes, tiempo de contacto y la dosis de nanopartículas de ZnO, observándose sus efectos en la variable dependiente desinfección de aguas residuales municipales, dentro de un marco de experimentos bajo condiciones controladas y de grupos aleatorizados, haciendo uso de estadística inferencial.
El desarrollo experimental de la investigación se realizó en el laboratorio de Bioprocesos de la Universidad Nacional del Centro del Perú, el cual se detalla de manera secuencia en el apartado 2.4 procedimiento experimental.
2.2. DISEÑO EXPERIMENTAL 2.2.1. Variables independientes
Las variables independientes tiempo de contacto y masa inicial de nanopartículas de ZnO, tal como se muestra en la tabla 1:
Tabla 2 Niveles máximos y mínimos de las variables independientes Indicador
es Dominio Experimental
NP-ZnO 10 mg 20 mg 40 mg
Dominio Experimental Tiempo
de contacto
3 h 6 h 9 h 12 h 15 h 18 h 21 h
24 h Fuente: Elaboración Propia
2.2.2. Variable dependiente
Inhibición de Microorganismos Indicadores:
Cantidad de inhibición de E. coli
2.2.3. Diseño de la investigación
Según el enfoque cuantitativo experimental y para determinar los efectos principales y las interacciones de las variables, se eligió el diseño de bloques completamente al azar (DBCA), donde existe a niveles para el factor A y b niveles para el factor B, existiendo a x b x n observaciones totales si se hacen n réplicas del experimento completo; para darle sustento
34 a la investigación se plantearon un necesario mínimo de 2 réplicas, por lo tanto existirán 32 observaciones en total en el desarrollo experimental con nueve grados de libertad (Montgomery, 2004).
2.3. MATERIALES, REACTIVOS Y EQUIPOS 2.3.1. Materiales
✔ 8 cajas Petri
✔ 30 tubos de ensayo
✔ Pitea de 20 mL
✔ Micropipeta
✔ 02 Vasos precipitados de 250 mL
✔ 02 vasos precipitados de 100 mL
✔ 02 fiolas de 25 mL
✔ Piseta
✔ Lunas de reloj
✔ Espátula
✔ Varillas
✔ Probeta de 50 mL
✔ 04 Matraz Erlenmeyer de 50 mL
✔ Gradilla
✔ Viales
✔ Espatula de Grigalsky
✔ Asa de siembra
✔ Papel aluminio
✔ Papel Kraft
✔ Papel filtro
✔ Algodón
✔ Mechero de Bunsen
✔ Filtro Gelman 2.3.2. Reactivos
✔ Caldo Mueller Hinton Broth
35
✔ Ortofosfato de dihidrógeno de potasio purificado anhidro (KH2PO4)
✔ ortofosfato de dihidrógeno de dipotasio purificado anhidro (K2HPO4)
✔ Cloruro de sodio (ClNa)
✔ Agar MacConkey
✔ Agar EMB con eousina y azul de metileno
✔ Alcohol
✔ Glutaraldehído
✔ Cacodilato de sodio
✔ Tetróxido de osmio
✔ Etanol 2.3.3. Equipos
Equipos Marca Modelo Ubicación
Autoclave SCIB 101 Lab. Bioprocesos
Dispersión de luz
Dinámica Nicomp Z300 Lab. Bioprocesos
Microscopio electrónico de barrido
Tescan Mira 3 Lab. Nanotecnología Medidor de
carbono orgánico total
Teledyne
Tekmar Torch Lab. Nanotecnología Sonificador Branson SFX 250 Lab. Bioprocesos Incubadora BioMed hh.nn.101 Lab. Bioprocesos Centrifugadora Dlab DM0412 Lab. Bioprocesos
2.4. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
2.4.1. Evaluación de la concentración inicial de bacterias E. Coli y tiempo de contacto con nanopartículas de ZnO para la desinfección del agua Para determinar el efecto de la concentración inicial de bacterias E. Coli y el tiempo de contacto de nanopartículas de ZnO en la desinfección del agua, se analizó el crecimiento de las diluciones dentro de las 24 horas en su cultivo en platos agar y fue contrastado con el crecimiento del control positivo sin la intervención de las nanopartículas de ZnO.
36 2.4.2. Evaluación de la concentración inicial de bacterias E. Coli que se
inactivan con nanopartículas de ZnO
A. Caracterización de las nanopartículas de ZnO
La caracterización de las nanopartículas de óxido de zinc se realizó en el equipo de dispersión de luz dinámica (DLS), para esto se siguió los siguientes procedimientos:
✔ Se disolvió 10 mg de nanopartículas de ZnO en 1 L de agua desionizada
✔ La muestra de nanopartículas de ZnO de 10 ppm se sónico durante 60 minutos, paso necesario para deshacer la aglomeración de las nanopartículas.
✔ Con la muestra sonicada se enjuago los viales a utilizar en el equipo DLS, en dicho equipo se puso como blanco un vial con agua desionizada.
✔ Un vial con la muestra sonicada fue introducida al equipo DLS donde se lectura el tamaño de las nanopartículas de ZnO.
B. Procedimiento para la toma de muestras de aguas residuales La toma de muestra solo se realizó para tener una base con respecto a la cantidad de microorganismos que presenta las aguas residuales. Para el desarrollo del trabajo de investigación se trabajó con aguas sintéticas residuales.
El procedimiento para la toma de muestra de agua residual de la PTAR del distrito de Sicaya se realizó siguiendo los procedimientos descritos en el N° 273-2013-Vivienda.
● Preparación de materiales y equipos: formatos (hoja de campo, cadena de custodia y rotulo de muestra, frascos de vidrio de 250 mL, cajas térmicas, refrigerantes, piseta agua destilada, preservantes químicos, GPS, pHmetro, guantes de latex, botas, casco, mascarilla y guardapolvo.
● Durante el muestreo, se ubicó el punto de monitoreo en un canal y se tomó la muestra a un tercio del tirante de la superficie, evitando sedimentos o partículas grandes.
37
● Se hicieron las mediciones de parámetros de campo, que fueron pH y temperatura, esto se realizó de forma inmediata a la toma de muestra, asimismo en la hoja de campo se registró las características de la muestra (color y olor).
● Las muestras de agua residual recolectadas se colocaron en una caja de almacenamiento térmica con ice pack como refrigerantes ya que deben estar a 4 °C para su transporte, esta muestra fue transportada al laboratorio de Bioprocesos de la UNCP para su análisis fisicoquímico.
C. Preparación de la solución COT
Conociendo las características fisicoquímicas de las aguas residuales se de la PTAR de Sicaya se preparó un agua sintética (solución COT), bajo estas condiciones para procurar la sobrevivencia de las E. coli.
Se preparó diferentes muestras de solución COT para llevarlos a analizar al Medidor de carbono orgánico total, para ello se siguió los siguientes procedimientos:
✔ Se esterilizó los materiales a utilizarse, como probeta, pipetas, matraz Erlenmeyer y varillas, en la autoclave durante 33 minutos.
✔ Se preparó 15 mL de solución de caldo Caldo Mueller Hinton Broth, para lo cual se pesó 0,315 g del caldo y se diluyó en un matraz Erlenmeyer con agua destilada, el matraz se tapó con algodón y papel aluminio y se metió a autoclavar durante 18 minutos.
✔ Se preparó la solución tampón pH 7,2; para esto se pesó 0,681 g de KH2PO4 y 0,895 g de K2HPO4, estos dos reactivos fueron diluidos en 50mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer, el cual fue tapado con algodón y papel aluminio e incubado durante 18 minutos.
✔ Después dela incubación del caldo Muller Hilton y de la solución tamponada se procedió a mezclar ambas soluciones en las siguientes proporciones:
Tabla 3 Proporción de caldo Muller Hilton y solución tamponada para la solución COT
N° Caldo Muller Hilton Solución tamponada
1 0,5 mL 9,5 mL
38
2 1,0 mL 9,0 mL
3 1,5 mL 8,5 mL
Fuente: Elaboración propia
✔ Las soluciones COT preparadas fueron analizadas en el Medidor de carbono orgánico total, lecturando el carbono orgánico total que presentaron, con estos resultados se armó una curva de calibración, que ayudó a determinar cuánto del caldo Muller Hilton es necesario para preparar una solución COT con 80 mg/L de carbono orgánico total.
D. Preparación de la solución salina
Se preparó 250 mL de solución salina, NaCl a 0,1 M, para determinar la masa de cloruro de sodio a utilizar se aplicó la siguiente formula:
𝑚𝑎𝑠𝑎𝑁𝑎𝐶𝑙 = 𝑛 × 𝑃𝑀 × 𝑉 𝑚𝑎𝑠𝑎𝑁𝑎𝐶𝑙 = 0,1𝑀 × 58,44 𝑔 × 0,25𝐿
𝑚𝑎𝑠𝑎𝑁𝑎𝐶𝑙 = 1,461 𝑔
Por lo tanto, se pesó 1,461 g de NaCl y se diluyó en 250 mL de agua destilada.
E. Preparación del agar McConkey
● En primer lugar, se esterilizó las cajas Petri, matraz de Erlenmeyer, tubos de ensayos, pipetas y varillas a utilizar en la autoclave durante 33 minutos.
● Se pesó 12,5 g del agar McConkey para diluirlo en 250 mL de agua destilada en un matraz Erlenmeyer, este matraz se tapó con algodón y papel aluminio y se autoclavó durante 18 minutos. Se preparó un poco más de agar debido a que dentro del autoclave una parte del agar se evapora.
● Antes de sacar el agar McConkey de la autoclave se desinfecto un espació del laboratorio con alcohol y se prendió un mechero de Bunsen.
● Con el mechero prendido y el agar McConkey recién salido de la autoclave se procedió a pasar el agar a las cajas Petri, se agregó aproximadamente 10 mL de agar a cada caja Petri, lo más rápido posible antes de que el agar se solidifique.
39 F. Activación de las E. Coli
Las cepas de las bacterias puras de E. Coli fueron compradas del laboratorio Gen Lab de la ciudad de Lima, por lo cual fue necesario su activación, que conllevo los siguientes procedimientos de acuerdo a(Alikhani et al., 2013):
● Las E. Coli se cultivaron en el medio Luria Bertani a un pH de 7,4, fueron incubados a 37 °C durante 24 horas, las bacterias que crecieron fueron monitoreadas a una densidad óptica de 600 nm.
● En la fase de crecimiento exponencial de las E. Coli fueron colectadas en pellets y centrifugados a 500 rpm durante 10 minutos.
● Las E. coli centrifugadas fueron lavadas con una solución buffer salina de fosfato a un pH de 7,2.
● Los pellets de las bacterias E. coli fueron resuspendidas en una solución buffer salina de fosfato.
● Los pellets de bacterias en suspensión fueron diluidos agua Milli- Q en celdas de vidrio Pirex esto requirió celdas de densidad correspondiente a 1 x 104 UFC/mL, 1 x 105 UFC/mL, 1 x 106 UFC/mL y 1 x 107 UFC/mL.
● En un tubo de ensayo con rosca se dispondrá 1,2 mL de caldo Muller Hilton con 9,8 mL de agua tamponada, a este, tubo se introducirá un pellet de E. coli a una concentración de 1 x 104 UFC/mL y se pondrá en el vortex para homogenizar y disolver la solución, posteriormente se incubara durante 30 minutos, tal como se observa en la figura 5, este procedimiento también se realizará para la concentración de E.
coli de 1 x 105 UFC/mL, 1 x 106 UFC/mL y 1 x 107 UFC/mL.
Figura 5: Disposición del pellet de bacteria en la solución COT Fuente: Elaboración propia
40 G. Diluciones
Antes de iniciar con las diluciones se autoclave lo tubos de ensayo a utilizarse durante 33 minutos y se preparó el ambiente limpiando todo con alcohol y encendiendo un mechero Bunsen, este procedimiento se siguió tomando en cuenta la investigación de (De los Santos y Picazzo Hentschel, 2019).
● En una gradilla para tubos de ensayo se dispuso 20 tubos de ensayo divididos en 4 columnas a los tubos de ensayo de la primera columna se les agregó 4,95 mL de solución salina, a los tubos de ensayo de la segunda, tercera y cuarta columna se les agrego 4,5 mL de solución salina.
● Dilución 1:10
Con ayuda de una micropipeta se sacó 0,05 mL de solución del tubo de ensayo que contiene los pellets de E. coli y solución COT y se agregó al primer tubo de la primera columna, este tubo se tapó con algodón y se llevó al vortex durante 10 segundos.
● Dilución 1:102
Descartando la punta de la micropipeta usada y usando una limpia, se sacó 0,5 mL del primer tubo de la primera columna y se agregó al primer tubo de la segunda columna y se selló este tubo con algodón, posteriormente 1 mL de la solución del primer tubo de la primera columna se agregó a una caja Petri que contenía el agar Mc Conkey enfriado, al mismo tiempo se flameó la espátula de Grigalsky y se utilizó para esparcir toda la solución en el agar, se cerró la caja Petri y se rotulo.
● Dilución 1:103
El primer tubo de la segunda columna se llevó al vortex durante 10 segundos y con una punta de micropipeta nueva se sacó 0,5 mL de solución y se agregó al primer tubo de la tercera columna, se selló este tubo con algodón, y se sacó 1 mL del primer tubo de la segunda columna y se agregó al agar de una caja Petri y se esparció con la espátula de Grigalsky flameada, seguidamente se selló la caja Petri y se rotuló.
● Dilución 1:104
41 El primer tubo de la tercera columna se llevó al vortex durante 10 segundos y con una punta de micropipeta nueva se sacó 0,5 mL de solución y se agregó al primer tubo de la cuarta columna, se selló este tubo con algodón, y se sacó 1 mL del primer tubo de la tercera columna y se agregó al agar de una caja Petri, esparciéndose con la espátula de Grigalsky flameada seguidamente se selló la caja Petri y se rotuló.
Finalmente se sacó 1 mL de la solución del primer tubo de la cuarta columna y se agregó alagar McConkey esparciéndose con la espátula de Grigalsky flameada, para después sellar la caja Petri y rotularla.
El esquema experimental de las diluciones se muestra en la figura 6.
Figura 6: Esquema de las diluciones Fuente: Elaboración propia
Las cajas Petri fueron incubadas durante 24 horas, después se sacaron y con el contador de colonias se contó las bacterias que crecieron en el agar McConkey.en el tiempo cero.
El procedimiento descrito se realizó para los cuatro pellets de E.coli que contenían las diferentes concentraciones.
2.4.3. Evaluación del tiempo de contacto entre las nanopartículas de ZnO con el E. Coli
● Antes de empezar a diluir se preparó la solución de nanopartículas de ZnO a 5 mM de acuerdo a Brayner et al., (2006), para lo cual, se pesó
42 15 mg de nanopartículas de ZnO y se diluyó en 100 mL de agua destilada.
● Se desinfecto toda el área a utilizar con alcohol y se prendió un mechero de Bunsen.
3 horas
a) Al tubo de ensayo que contiene la solución COT (Caldo Muller Hilton y solución tamponada) con el pellet de E. coli, se le agregó 1 mL de solución de nanopartículas de ZnO y se llevó al vortex, al cabo de 15 minutos se sacó 0,05 mL y se agregó al segundo tubo de la primera columna, este tubo se tapó con algodón y se llevó al vortex durante 10 segundos.
b) Posteriormente se sacó 0,5 mL del segundo tubo de la primera columna y se agregó al segundo tubo de la segunda columna y se selló este tubo con algodón, seguidamente se sacó 1 mL de la solución del segundo tubo de la primera columna y se agregó a una caja Petri que contenía el agar Mc Conkey enfriado, al mismo tiempo se flameó la espátula de Grigalsky y se utilizó para esparcir toda la solución en el agar, se cerró la caja Petri y se rotulo.
c) El segundo tubo de la segunda columna se llevó al vortex durante 10 segundos y con una punta de micropipeta nueva se sacó 0,5 mL de solución y se agregó al segundo tubo de la tercera columna, se selló con algodón, y se sacó 1 mL del segundo tubo de la segunda columna y se agregó al agar de una caja Petri y se esparció con la espátula de Grigalsky flameada, seguidamente se selló la caja Petri y se rotuló.
d) El segundo tubo de la tercera columna se llevó al vortex durante 10 segundos, seguidamente se sacó 0,5 mL de solución y se agregó al segundo tubo de la cuarta columna, se selló este tubo con algodón, y se sacó 1 mL del segundo tubo de la tercera columna y se agregó al agar de una caja Petri, esparciéndose con la espátula de Grigalsky flameada seguidamente se selló la caja Petri y se rotuló.
e) Finalmente, del segundo tubo de la cuarta columna se sacó 1 mL de solución y se esparció en al agar MaConkey con la espátula de Grigalsky flameada, para posteriormente sellar la caja Petri y rotularla.