INTRODUCCIÓN
Enfermedad de Chagas: agente causal, epidemiología, transmisión, cuadro clínico e
Una vez al final del intestino, se diferencian en la zona rectal en tripomastigotes metacíclicos capaces de infectar (Stevens et al., 2011). En el caso de la ruta del vector se puede observar inflamación local (chagoma) o en el párpado (signo de Romaña) (Stevens et al., 2011).
Respuesta inmune contra la infección de Trypanosoma cruzi
- Inmunidad innata
- Sistema del complemento
- Fagocitos en la respuesta inmune contra Trypanosoma cruzi
- Células dendríticas
- Células Natural Killer (NK)
- Inmunidad adaptativa
- Linfocitos B
- Linfocitos CD4+
- Linfocitos CD8+
Asimismo, el aumento en la síntesis de IFN-γ y TNF-α promueve la producción de óxido nítrico (NO) mediante la oxidación de L-arginina mediante la acción de la óxido nítrico sintasa inducible (iNOS). Inglés) (Teixeira et al., 2002). Además, los epítopos de las trans-sialidasas inducen inmunodominancia en etapas superiores de la infección en ratones, lo que describe la respuesta citotóxica de las células T CD8+ (Martin et al., 2006).
ANTECEDENTES
Antígeno Tc24 como candidato para el desarrollo de vacunas contra la Enfermedad de
Los resultados demuestran la producción de anticuerpos IgG específicos, la reducción de la parasitemia y una supervivencia superior al 80% frente al desafío infeccioso experimental (Cazorla et al., 2015; Cerny et al., 2016; Matos et al., 2016). En consecuencia, la administración oral de antígenos indujo una respuesta inmune a nivel de la mucosa detectada mediante la producción de IgA específica de antígeno (Cazorla et al., 2015; Matos et al., 2016). Anteriormente se ha evaluado como vacuna profiláctica y terapéutica en ratones (Dumonteil et al., 2004; Limon-Flores et al., 2010).
Además, se redujo la parasitemia, la inflamación cardíaca y la presencia del parásito en el tejido cardíaco (Quijano-Hernández et al., 2013). Otro enfoque implica modificaciones dirigidas a la secuencia de aminoácidos en el antígeno Tc24, cambiando las cisteínas por serinas (Seid et al., 2017). Los resultados demuestran la producción de anticuerpos IgG específicos y una inducción de respuestas inmunes celulares asociadas con la producción de IFN-γ (Dumonteil et al., 2020).
En este contexto, la producción de antígenos recombinantes se realiza alternativamente en plantas y microalgas donde se han demostrado ventajas como bajo costo, fácil cultivo y alto rendimiento (Rosales-Mendoza y Salazar-González, 2014; Rosales-Mendoza et al. al. . ., 2016). Curiosamente, las vacunas recombinantes producidas en la plataforma de microalgas contra la EC aún no se han investigado (Rosales-Mendoza et al., 2012).
Péptido Co1 (Ligando de células M) como adyuvante de mucosas
En este sentido, el péptido Co1 es un ligando para células M que ha sido objeto de varios experimentos en los que se observa un potencial uso como adyuvante para vacunas orales (Kim et al., 2013). El uso de este péptido se basa en el hecho de que, cuando Co1 se conjuga con el antígeno de interés, el ligando se une a las células M, que son células epiteliales especializadas que capturan antígenos de la luz intestinal y los entregan al folículo subyacente. parches de Peyer, asegurando un reconocimiento eficiente de antígenos por parte del sistema inmunológico de la mucosa (KuoLee y Chen, 2008). En un estudio anterior, el péptido Co1 se utilizó como adyuvante del antígeno EDIII del virus del dengue (Kim et al., 2018).
En este estudio, se encontró que la administración de Co1 ligada al C-terminal de EDIII aumentaba la producción de anticuerpos IgA e IgG específicos, así como de IL-2, IL-17 e IFN-γ. En otro experimento, la Co1 unida al antígeno NS3 del virus del dengue aumentó la producción de IFN-γ en las células del bazo y las placas de Peyer, además de inducir una respuesta celular citotóxica. Debido a lo anterior, el péptido Co1 representa un potencial de gran interés para su uso como adyuvante mucoso en el desarrollo de una vacuna oral contra T.
Microalgas como plataformas de producción y vehículos de entrega de vacunas
Además, presenta compuestos inmunoestimulantes que pueden potenciar la respuesta a la vacuna, aunado a que no contiene ningún componente tóxico que pueda causar daño al ser humano (Mioso et al., 2014). Los elementos del vector viral están en el siguiente orden: promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor, gen AlcR, terminador de la nopalina sintasa (nos), Ori, promotor AlcA, los sitios de restricción Sma I, Bam HI y Pst I, terminador 35S, Ori , el promotor AlcA y la proteína Rep (Bañuelos-Hernández et al., 2017). Una vez confirmada la presencia del transgén, se evaluó la presencia y eficiencia de producción de los antígenos recombinantes 12, 24 y 48 horas después del cocultivo.
Los resultados muestran el uso potencial del sistema Algevir para la producción de antígenos vacunales para administración oral (Bañuelos-Hernández et al., 2017). Otro ejemplo del uso del sistema Algevir es la producción de la vacuna candidata contra la enfermedad de Alzheimer utilizando LTB como adyuvante. En este estudio se analizó la capacidad bioencapsulante de la pared celular de la microalga Schizochytrium sp.
Por todo lo anterior, el sistema Algevir resulta un sistema atractivo para producir una vacuna -en plataformas vegetales y microalgas- contra T. Representación gráfica del mecanismo de acción de la vacuna contra la enfermedad de Chagas producida en plantas y microalgas, con un refuerzo parenteral que consiste del antígeno recombinante Tc24 y el adyuvante MPLA.
JUSTIFICACIÓN
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
Objetivo general
Objetivos particulares
MATERIAL Y MÉTODOS
- Generación de la construcción genética Tc24:Co1 y evaluación de las características
- Diseño del gen y del vector de expresión
- Predicción de antigenicidad y alergenicidad
- Evaluación de las propiedades fisicoquímicas de Tc24:Co1
- Predicción de la estructura secundaria
- Predicción, refinamiento y validación de la estructura terciaria
- Docking de la vacuna Tc24:Co1 con Toll-Like Receptor 4 (TLR-4) y TLR-2
- Clonación molecular
- Expresión de la proteína recombinante Tc24:Co1 y determinación de la eficiencia de
- Análisis molecular para la detección de transgenes
- Obtención de sueros en ratones hiperinmunes
- Análisis de proteína Tc24:Co1
- Evaluación de la inmunogenicidad de Schizochytrium sp.-Tc24:Co1 a través de la
- Evaluación de la eficacia protectora de Schizochytrium sp.- Tc24:Co1 ante un reto
- Declaraciones de ética
- Ratones y parásitos
- Inmunización oral e Infección experimental
- Análisis estadísticos
La predicción de la estructura terciaria de Tc24:Co1 se realizó utilizando el servidor GalaxyTBM (http://galaxy.seoklab.org/cgi-bin/submit.cgi?type=TBM) utilizando la proteína cristalizada hibridación PDB ID: 3CS1, correspondiente a la proteína flagelar fijadora de calcio (Tc24) de T.cruzi. Una vez purificadas las bandas, se realizó la subclonación del constructo Tc24:Co1:pAlgevir. Los oligos se diseñaron para detectar los insertos Tc24:Co1, confirmar la transformación y enviarlos para secuenciación (Tabla 2).
El ensayo de expresión transitoria se realizó de la siguiente manera: un inóculo de 1 ml de cultivo A. Se inmunizaron ratones (n=2) en la almohadilla de la pata trasera el día 1 con 10 µg de rTc24 emulsionado en 10 µl de adyuvante completo de Freud (CFA). . Para eliminar las impurezas del extracto, la precipitación de proteínas se realizó de la siguiente manera: se agregaron 100 µl de ácido tricloroacético (TAC) al 20 % a 100 µl del extracto de proteínas.
Para analizar la actividad inmunogénica de la vacuna oral Tc24:Co1 se implementó el siguiente diseño de inmunización. Para confirmar la infección, se midió la parasitemia en una cámara de Neubauer examinando sangre fresca extraída de la cola del ratón el día 12 después de la infección, continuando el análisis de parásitos cada 3 días hasta el día 48 después de la infección.
RESULTADOS
Generación de la construcción genética Tc24:Co1 y evaluación de las características
- Diseño del gen y del vector de expresión
- Predicción de antigenicidad y alergenicidad
- Evaluación de las propiedades fisicoquímicas de Tc24:Co1
- Predicción de la estructura secundaria
- Predicción, refinamiento y validación de la estructura terciaria
- Docking de la vacuna Tc24:Co1 con Toll-Like Receptor 4 (TLR-4) y TLR-2
- Clonación molecular
Luego, la proteína Rep media la replicación del casete de expresión mediante el reconocimiento de elementos Ori, que amplifican la expresión del gen Tc24:Co1. Vaxijen v2.0 y AntigenPro estimaron la predicción de Tc24:Co1 en 0,911 y 0,75, respectivamente, y se consideró no alergénica según el servidor web AlgPred. El análisis utilizando PatchDock generó 10 patrones de unión de Tc24:Co1 a TLR-4 y TLR-2, que fueron refinados y clasificados por FireDock.
En el cuadro de la derecha se observan interacciones de un doble enlace de hidrógeno entre el aminoácido LYS 324 de la cadena B de TLR-4 con GLY 28 y SER 32 de Tc24:Co1. En primer lugar, se cortó pAlgevir para poder clonar la secuencia Tc24:Co1 (Fig. 10). Posteriormente se realizó la liberación de los insertos Tc24:Co1 contenidos en el vector pUC57 (Fig. 11).
Carriles: M, marcador de peso molecular de ADN de 1 kb (New England Biolabs); Pos., control positivo utilizando el vector pUC57:Tc24:Co1; Carriles 1 a 5, ADN de colonias de E. Carriles: M, marcador de peso molecular de ADN de 1 kb (New England Biolabs); Pos., control positivo utilizando el vector pUC57:Tc24:Co1; Neg., control negativo; carriles 1 a 4, ADN de colonias de A.
Expresión de la proteína recombinante Tc24:Co1 y determinación de la eficiencia de
- Transformación transitoria de Schizochytrium sp. por medio de A. tumefaciens para la
Los niveles de expresión de la proteína recombinante se determinaron mediante ELISA a las 48 horas después de la inducción con etanol.
Evaluación de la inmunogenicidad de Schizochytrium sp.-Tc24:Co1 a través de la
- Respuesta de anticuerpos a nivel mucosa y sistémico por la inmunización con
- Respuesta de citocinas Th1/Th2 en suero de ratones ante la inmunización de
Respuesta de anticuerpos específicos anti-Tc24 tras la inmunización con las microalgas que expresan Tc24:Co1. La respuesta de IgG específica se midió en suero mediante ELISA, utilizando una dilución de [1:20] para el suero de ratones inmunizados por vía oral, y una dilución de [1:320] para el suero de ratones inmunizados por vía intraperitoneal. Los ratones inmunizados con ambas dosis de Schizochytrium sp.-Tc24:Co1 aumentaron (P < 0,05) las cuatro citoquinas evaluadas (IFN-γ, IL-2, IL-4 e IL-10) en comparación con PBS y controles de Schizochytrium sp.
La concentración de citocinas se determinó comparando los datos obtenidos con una curva estándar.
Evaluación de la eficacia protectora de Schizochytrium sp.- Tc24:Co1 ante un reto
Regulation of Trypanosoma cruzi infection in mice by gamma interferon and interleukin 10: role of NK cells. Vaccine-associated chemotherapy induces IL-17 production and reduces cardiac pathology during acute Trypanosoma cruzi infection. Relative contribution of antibody production and CD8+ T cell function to Trypanosoma cruzi immune surveillance.
NK cells contribute to the control of Trypanosoma cruzi infection by killing free parasites by perforin-independent mechanisms. Effect of a combination DNA vaccine for the prevention and therapy of Trypanosoma cruzi infection in mice: Role of CD4+ and CD8+ T cells. Expression, purification, immunogenicity and protective efficacy of a recombinant Tc24 antigen as a vaccine against Trypanosoma cruzi infection in mice.
Limited role for helper CD4+ T cells in the priming of Trypanosoma cruzi-specific CD8+ T cells. Role of helper/inducer T cells and natural killer cells in resistance to Trypanosoma cruzi infection. A multi-parametric analysis of Trypanosoma cruzi infection: common pathophysiological patterns beyond the extreme heterogeneity of host responses.
In silico identification of novel targets for diagnosis, vaccines and drug candidates against Trypanosoma cruzi.
DISCUSIÓN
CONCLUSIONES
LITERATURA CITADA
Detection of live Trypanosoma cruzi in tissues of infected mice using histochemical staining for β-galactosidase. Trypanosoma cruzi protein subfamily TcTASV-C administered with U-Omp19 induces a protective response against lethal challenge in mice. A novel multi-epitope recombinant protein elicits an antigen-specific CD8+ T cell response in Trypanosoma cruzi-infected mice.
Investigation of antigenic proteins of Trypanosoma cruzi to produce an epitope-based subunit vaccine by exploiting epitope mapping mechanism. A prime-boost immunization with Tc52 N-terminal domain DNA and the recombinant protein expressed in Pichia pastoris protects against Trypanosoma cruzi infection. Stable transfection of Trypanosoma cruzi epimastigotes with the trypomastigote-specific complement regulatory protein cDNA confers complement resistance.
A novel cell surface transsialidase of Trypanosoma cruzi generates a stage-specific epitope required for invasion of mammalian cells. Tumor necrosis factor alpha mediates resistance to Trypanosoma cruzi infection in mice by inducing nitric oxide production in infected gamma interferon-activated macrophages.
ANEXOS
