El objetivo principal de este trabajo fue estudiar la fisiología de la levadura Kluyveromyces marxianus debido a la influencia de la temperatura durante el cultivo, así como evaluar el efecto de diferentes concentraciones de calcio y magnesio en el medio de cultivo, utilizando como ensayo la actividad fructanasa. . respuesta.. Por otro lado, se utilizaron técnicas para evaluar el estado fisiológico de la cepa, estas técnicas fueron microscopía de fluorescencia y espectroscopía dieléctrica para determinar la viabilidad del cultivo, y otras técnicas utilizadas fueron la cuantificación del tamaño celular y el cultivo en placa (UFC). .
Generalidades de las levaduras
Clasificación, taxonomía y filogenia
El potencial de diversidad filogenética de las levaduras es morfológicamente simple debido a sus estados sexuales que pueden clasificarse en dos grandes clases de hongos, Ascomycetes y Basidiomycetos [2], debido a estudios moleculares que han demostrado que se derivan de estos dos linajes monofiléticos principales. . . Otro grupo que incluye los ascomicetos es el Archiascmycetes, que se refieren a la posición evolutiva temprana de las levaduras y las formas de levadura [7].
Características morfológicas
16 puede influir en el tamaño de la levadura, la etapa del ciclo celular y la edad de las células individuales. La mayoría de las levaduras presentan gemación multilateral y un tipo de división celular en la que la célula hija aparece en gran parte de la superficie celular, como es el caso de Saccharomyces.
Hábitat y ecología
Por otro lado, existen especies en las que la yema (célula hija) aparece en el poro de la levadura, lo que da como resultado una morfología tipo limón muy característica. 17 presencia depende principalmente de la disponibilidad de carbono orgánico, la temperatura, el pH y la presencia de agua.
Fisiología de levaduras
- Crecimiento
- Requerimientos físicos para el crecimiento
- Reproducción
- Nutrición
- Metabolismo
- Evaluación de la fisiología celular
- Microscopia de fluorescencia
- Espectroscopia dieléctrica
- Sistema de análisis y conteo de células
En la Tabla 2 se muestra una categorización de las levaduras según sus propiedades fermentativas y su respuesta al crecimiento en función de la disponibilidad de oxígeno. Tanto las células madre como las hijas están adyacentes entre sí en la pared durante el desarrollo de las yemas.
Kluyveromyces marxianus
Taxonomía y filogenia
Actualmente, se utilizan estudios de secuenciación multigénica para dilucidar la filogenia de diferentes cepas [37]. Ambos géneros son parte del "complejo" de Saccharomyces, en sí mismo una subclase dentro de las saccharomycotinas o hemiascomicotas [40].
Características generales
- Termotolerancia
- Metabolismo
- Producción de enzimas
- Importancia y aplicaciones biotecnológicas
Este fenómeno se denomina efecto Crabtree y se postula que proporciona una ventaja competitiva en determinados nichos ecológicos [45]. marxianus generalmente se clasifica como Crabtree negativo, porta los genes necesarios para la producción de etanol y adoptará el estilo de vida bajo ciertas condiciones, pero es necesario recalcar que existe conflicto respecto a esta clasificación, ya que en algunos estudios se ha reportado como Cabtree positivo [44]. En cuanto a estudios bioquímicos sobre enzimas de interés industrial, K. marxianus ha sido utilizado como fuente de producción de inulinasas, ß-galactosidasas, ß-glucosidasas y endopoligalacturonasas como se muestra en la tabla 1. Estudios bioquímicos de producción de enzimas de interés industrial.
Fructanasas
- Usos y aplicaciones
La lactosa se considera el principal inductor de la síntesis de β-Dgalactosidasa [49] y de la producción de K lactasa. A pesar de la baja similitud de secuencia dentro de los módulos sándwich, todos los miembros de la familia 32 contienen un módulo [57].
Objetivo General
Objetivos específicos
Los cambios de temperatura y la adición de diferentes concentraciones de calcio y magnesio al medio de cultivo afectarán el estado fisiológico de Kluyveromyces marxianus, lo que se reflejará en la producción de fructanasas.
Materiales
- Microorganismo
- Medios de cultivo
En la fase de estudio fisiológico se utilizó el medio químicamente definido descrito en la Tabla 6. Tanto las vitaminas como los oligoelementos se esterilizaron mediante filtración con membrana de 0,2 μm y por separado las sales se esterilizaron térmicamente.
Métodos
- Preparación del inóculo
- Técnicas para evaluar la fisiología
- Cuantificación de la población
- Microscopia de fluorescencia
- Espectroscopia dieléctrica (sonda de capacitancia)
- Unidades formadoras de colonia (UFC)
- Consumo de sustrato
- Determinación de azúcares totales
- Determinación de azúcares reductores
- Actividad fructanasa
- Caracterización del extracto enzimático
- Efecto de la fuente de carbono y la temperatura
- Efecto de la temperatura, calcio y magnesio
- Cultivo en biorreactor para evaluar la fisiología
Primero, se tomó una muestra del cultivo en condiciones estériles, luego se realizaron las diluciones seriadas pertinentes para obtener de 500 a 1000 células en la muestra, luego se colocaron 100 µl de la muestra en la placa de Petri y se esparcieron sobre la placa. Para evaluar el efecto de diferentes fuentes de carbono y temperatura en la inducción de la actividad fructanasa, se realizaron fermentaciones discontinuas a nivel de matraz, que se realizaron por duplicado. Experimento para determinar el efecto de la temperatura y el medio de cultivo sobre la actividad de la fructanasa.
Se realizó un diseño experimental multifactorial con dos para evaluar el efecto de la temperatura y los minerales (calcio y magnesio) en la producción de actividad fructanasa. Al igual que con el cultivo por lotes, se realizaron mediciones para evaluar la fisiología de la cepa durante el cultivo y la producción de enzimas.
Caracterización del extracto enzimático
Finalmente, se evaluó la concentración de sustrato. Como podemos ver en la Figura 11, el 1% de sustrato fue la mejor condición.
Efecto de la fuente de carbono y temperatura en la inducción de actividad
- Crecimiento
- Actividad fructanasa
52 del pH observamos que la actividad enzimática permanece constante alrededor de 1 a 1,2 U/ml al pH probado. 53 fuentes de carbono a una temperatura de cultivo de 22°C, estimándose que la mayor población se obtuvo utilizando fructanos de agave como fuente de carbono, alcanzando más de 500x106 células/ml, en el caso de la glucosa y la fructosa observamos que la cepa tuvo un comportamiento similar. . , se obtuvo una población máxima de aproximadamente 100x106 células/ml. Uno de los aspectos importantes a tener en cuenta es que existe un mayor crecimiento de la cepa sobre fructanos de agave en relación con otras fuentes de carbono utilizadas, las Figuras 12 a 15 muestran que el mayor crecimiento ocurre cuando la cepa se inocula en un medio con fructanos de agave como fuente de carbono independientemente de temperatura del cultivo.
Esto puede deberse a que los fructanos de agave son una fuente compleja de carbono rica en minerales, lo que puede beneficiar el crecimiento de la cepa en su presencia. Como podemos observar en las siguientes gráficas (Figuras 16 a 19), la cinética de la actividad de la fructanasa se presenta de acuerdo a diferentes temperaturas y diferentes fuentes de carbono utilizadas, donde se puede observar que la actividad fue mayor al utilizar fructanos de agave como fuente de carbono. a todas las temperaturas en comparación con la fructosa y la glucosa.
Efecto del medio de cultivo en el crecimiento y la actividad fructanasa
- Crecimiento
- Actividad fructanasa
Como ya sabemos la temperatura es un factor importante en el crecimiento de los microorganismos, en un estudio realizado por Urit et al. 62, como el potasio y el magnesio, generalmente se requieren para el crecimiento de la levadura en el rango de concentración milimolar, y los metales traza como calcio, manganeso, zinc, hierro y cobre se requieren en el rango micromolar [70]. Algunas paradas de fermentación parecen estar relacionadas con una deficiencia de vitaminas en el mosto [71], aunque esto es raro.
La vitamina más estudiada es la tiamina, cuya concentración en la sidra oscila entre 150 y 750 g/l. 63 Tanto en el ambiente mineral como en el ambiente químicamente definido, se observa que la máxima actividad se encuentra a 32,5°C; algunos autores han utilizado 30°C para la producción de inulinasas [67,68,72].
Cultivo en biorreactor (batch)
- Cinética de crecimiento
- Consumo de sustrato
- Actividad enzimática
- Viabilidad
- Actividad metabólica
- Permitividad
- Diámetro celular
67 representa un impacto importante en su producción, demostrando que un pH inferior a 4 provoca una disminución en la producción de enzimas. Utilizamos dos técnicas para evaluar la viabilidad durante el cultivo por lotes. La Figura 29 también muestra que los datos de la sonda de capacitancia concuerdan con los obtenidos mediante microscopía de fluorescencia y también muestran que se correlacionan con el crecimiento de la cepa durante el cultivo.
El tamaño de la cepa se controló durante el cultivo con el Sistema de Análisis y Conteo de Células (CASY®). Se observa que el diámetro no varió durante el cultivo, manteniéndose en 4,5 µm desde el inicio de la fermentación, lo que hace suponer que la cepa no estuvo estresada durante el cultivo.
Efecto de la temperatura, calcio y magnesio
- Crecimiento
- Consumo de la fuente de carbono
- Actividad fructanasa
- Diámetro
Dado que en el caso de los experimentos realizados a 37 °C (Figura 33) observamos un comportamiento completamente diferente a los presentados en los gráficos anteriores, el mayor crecimiento se produce a concentraciones altas de magnesio (250 mg/l) en combinación con niveles medios. de calcio (750 mg/l), lo que pone de relieve que a esta temperatura se consiguió un crecimiento menor que a temperaturas inferiores a 30 °C. Sin embargo, las temperaturas por encima del óptimo dan como resultado una disminución de la estabilidad de la enzima. Uno de los aspectos importantes que reflejan el estado fisiológico de los microorganismos es su tamaño; Se utilizó CASY® para evaluar el efecto de la temperatura y diferentes concentraciones de calcio y magnesio sobre el diámetro de la levadura.
La Figura 42 muestra la gráfica de distribución de los promedios con respecto a la temperatura; Se puede observar claramente que en cada una de las diferentes condiciones el diámetro del tramo varió. La Figura 43 muestra la gráfica de distribución del diámetro promedio respecto a las diferentes concentraciones de calcio utilizadas en el medio de cultivo. Vemos que cuanto mayor es la concentración de calcio en el medio, el diámetro de la levadura parece permanecer estable.
Cultivo en biorreactor (continuo)
- Cinética de crecimiento y consumo de sustrato
- Actividad enzimática
- Viabilidad y actividad metabólica
- Diámetro y Morfología
Se tomaron 100 fotografías diferentes a lo largo del cultivo para observar la morfología de la cepa. Además, el análisis de estas fotografías nos permitió encontrar cambios en la morfología de la cepa a lo largo del cultivo. Pulse los fructanos de agave para observar el efecto de la producción de fructanasa durante el cultivo continuo.
Pruebe otras fuentes de carbono para observar el efecto de la producción de fructanasa en condiciones limitantes del sustrato. EL EFECTO DE LA TEMPERATURA SOBRE LA INDUCCIÓN DE UNA FRUCTANASA CON FRUCTANO DE AGAVE DE Kluyveromyces marxianus. Se evaluó el efecto de la temperatura sobre la producción de fructanasa, logrando la actividad máxima de 2,0 U/ml a 32,5ºC.
Hasta el momento no se ha investigado la influencia de la temperatura en la producción de fructanasas en K.
