Victoria, Tamaulipas, por las instalaciones brindadas para la captura y mantenimiento de la colonia de moscas H. Se realizó análisis de expresión y polimorfismo del proteasoma y componente de la respuesta inmune unigenes, lo que permitió observar expresión diferencial en diferentes etapas evolutivas y que estas son altamente secuencias conservadas. Kits de oligonucleótidos y condiciones para RT-PCR en tiempo real utilizados para el análisis de H.
Matrices de oligonucleótidos y condiciones para RT-PCR en tiempo real utilizadas para analizar la expresión en diferentes etapas evolutivas y tejidos, así como la variabilidad genética en diferentes tejidos. Conjuntos de oligonucleótidos y condiciones para RT-PCR en tiempo real utilizados para analizar transcripciones microbianas en H.
INTRODUCCIÓN
Los avances en el desarrollo de vacunas contra artrópodos se limitan a las garrapatas, con pocos o ningún resultado en moscas. En el desarrollo de vacunas contra las garrapatas se han utilizado diversos métodos, como la identificación de proteínas específicas mediante mapeo inmunológico (Wang y Nuttall, 1999) y la identificación de proteínas de las glándulas salivales e intestino de las garrapatas (de la Fuente y Kocan, 2003) así como la interferencia de ARN (RNAi). De la Fuente et al b y 2010), han utilizado con éxito ARNi para buscar antígenos protectores contra las garrapatas, logrando identificar algunos genes candidatos para el desarrollo de vacunas contra el ataque de garrapatas.
REVISIÓN DE LA LITERATURA
- Haematobia irritans
- Clasificación taxonómica
- Características morfológicas
- Hábitos alimenticios
- Ecología
- Ciclo biológico
- Efectos del parasitismo de H. irritans sobre el ganado bovino
- Importancia económica de H. irritans
- Importancia sanitaria de
- Control de H. irritans
- Biológico
- Mecánico
- Químico
- Resistencia de H. irritans a los insecticidas
- Alternativas de Control Inmunológico
- Herramientas para la detección de antígenos protectores contra
- Las etiquetas de secuencias expresadas (Expressed Sequence Tag,
- Interferencia de ARN (iARN)
Además, se produce una pérdida de calidad en la piel, provocada por el efecto escozor (Mariategui et al., 2004). El antígeno Bm86 y posteriormente Bm95 fueron identificados en células intestinales de la garrapata Rhipicephalus (Boophilus) microplus (Willadsen y Kemp, 1998 García-García et al., 2000). Esta metodología se describió por primera vez en el nematodo Caenorhabditis elegans (Fire et al., 1998; Novina y Sharp, 2004).
Estos estudios permitieron conocer el papel de la subolesina en la modulación de la alimentación y reproducción de garrapatas de diferentes especies (de la Fuente et al., 2006). La alimentación de Phlebotomus perniciosus con anticuerpos contra la proteína ortóloga subolesina inhibió la supervivencia de las hembras, el número de larvas (28 ± 22%) y adultos (16 ± 3%) eclosionados (Canales et al., 2009).
JUSTIFICACIÓN
HIPÓTESIS
OBJETIVOS
Objetivo General
Objetivos Específicos
MATERIALES Y MÉTODOS
- Cultivo de H. irritans
- Construcción de la biblioteca de ADNc
- Extracción de ARN
- Obtención del ADNc
- Clonación del ADNc en el vector pBluescript II SK
- Transformación de la biblioteca de ADNc
- Análisis bioinformático de secuencias de ADNc
- Caracterización funcional de ADNc de H. irritans mediante iARN
- Generación de ARN de doble cadena (ARNdc)
- Inyección de moscas con ARNdc
- Confirmación de la expresión de genes después de la iARN
- Expresión de genes seleccionados en diferentes estadios evolutivos y
- Polimorfismo de genes seleccionados en diferentes poblaciones de H
- Amplificación y clonado del ADNc de los genes seleccionados
- Análisis bioinformático de las secuencias de ADNc de los genes
- Prevalencia de patógenos en H. irritans
El tamaño de los fragmentos amplificados se determinó por comparación con un marcador de peso molecular para ADN (escalera de ADN de 1 Kb, Promega, Madison, Wisconsin, EE.UU.) mediante electroforesis en gel de agarosa al 1,1%. Para la transformación de la biblioteca de ADNc se utilizaron 50 l de células competentes (DH-5α), a las que se mezcló 1 l de los productos de ligación. suavemente y se incuba durante 50 minutos a 4°C. Se muestra la función putativa de los genes seleccionados y los unigenes utilizados para RNAi.
Después de construir los pools de clones y generar el dsRNA de los pools seleccionados y el del control negativo (Tabla 1), se utilizaron 8 μl de los amplicones purificados para la transcripción in vitro y la purificación del dsRNA de cada pool usando Megascript. ARNi (Ambion, Austin, Texas, EE. UU.). Se realizaron 2 experimentos de ARNi con cada uno de los 9 grupos seleccionados según su función putativa, incluidos dos grupos de control negativo (tampón de elución y ARNbc no unido). El ARN se analizó mediante transcripción de los genes diana mediante RT-PCR en tiempo real utilizando oligonucleótidos específicos para cada unigene de las matrices de ADNc experimentales (Tabla 2).
Conjunto de oligonucleótidos y condiciones para RT-PCR en tiempo real utilizados para el análisis de H. EST. El análisis funcional de los genes seleccionados reveló algunos genes involucrados en las funciones biológicas que permiten la supervivencia y reproducción de H. Para la transformación del ADNc de H. se utilizaron 50 µl de células competentes (Escherichia coli JM109), a las que se añadió 1 µl de los productos de ligación, se mezclaron suavemente y se incubaron durante 20 min a 4ºC.
Los fragmentos de los genes seleccionados se amplificaron mediante PCR utilizando los oligonucleótidos específicos para cada gen (Tabla 3), el PCR Master Mix System (Promega, Madison, Wis., EE.UU.), en una mezcla de reacción de 25 µl que contenía 1 µl de ADNc contenido. . un termociclador (2720 Applied Biosystems, Foster City, CA, EE. UU.). Los productos de la PCR se visualizaron en un gel de agarosa al 1 % para comprobar el tamaño de los fragmentos amplificados en comparación con un marcador de peso molecular (escalera de ADN de 1 Kb, Promega, Madison, Wisconsin, EE. UU.). Las secuencias de los genes seleccionados se compararon entre las diferentes poblaciones y la de la colonia de laboratorio para determinar variaciones en las secuencias.
RESULTADOS
- Construcción de una biblioteca de ADNc de H. irritans
- Análisis bioinformático de secuencias de ADNc
- Caracterización funcional de ADNc (ESTs) de H. irritans mediante iARN
- Polimorfismo de genes seleccionados en diferentes poblaciones de H
- Prevalencia de patógenos en H. irritans
El análisis de secuencia de las serina proteasa unigenes mostró que, aunque algunas de ellas pueden ser parálogas (es decir, unigenes 1–2 y 3–5), otras probablemente reflejan polimorfismos de secuencia en la población de moscas H. Con base en los resultados obtenidos del análisis bioinformático y asignación de funciones moleculares, se seleccionaron los grupos funcionales de unigenes a caracterizar por RNAi, como se muestra en la Tabla 1. Para las secuencias de los grupos 8 y 9, el silenciamiento génico no se detectó hasta después 12 caballos de fuerza.
En la mayoría de los casos, el silenciamiento de la expresión genética fue superior al 70% en comparación con el grupo de control. La Figura 9 muestra los resultados del silenciamiento génico en los tres grupos analizados, lo que sugiere efectos no específicos del ARNi en moscas H. Cuando la expresión de la respuesta inmune y los genes 5'-NUC se extinguieron en moscas h.
La expresión de silenciamiento génico (% de media + DE) en relación con el grupo de control se determinó mediante RT-PCR en tiempo real a 12 hpi en moscas (N = 4) inyectadas con diferentes dsRNA en los tres grupos funcionales indicados. De acuerdo a los resultados obtenidos en la caracterización de grupos funcionales de unigenes mediante RNAi y la evaluación del silenciamiento génico, se seleccionaron unigenes que mostraron efecto sobre la mortalidad y oviposición de moscas H. Entre los grupos funcionales con efecto biológico seleccionado se encuentran los siguientes unigenes: 6_F11, proteína inmunomoduladora de células T (PIT), 10_G05, inhibidor de la RNasa L (IAL), 7_A04, subunidad beta del proteasoma (P beta) y 12_H09, proteína de maduración del proteasoma (PMP).
Los niveles de expresión de los genes IAL y P beta en las etapas inmaduras de las moscas disminuyeron a medida que el desarrollo progresó desde huevos hasta pupas (Figura 12 B y C), mientras que para los genes PIT y PMP los niveles aumentaron desde huevos hasta pupas. (Figura 12 A y D), pero los niveles de expresión de PIT más bajos se obtuvieron en la etapa de pupa (Figura 12 A). Análisis de la expresión de genes para la proteína inmunomoduladora de células T (PIT), el inhibidor de la RNasa L (IAL), la subunidad beta del proteasoma (P-beta) y la proteína de maduración del proteosoma (PMP) en diferentes etapas evolutivas y tejidos de moscas H. Polimorfismo genético Se realizó un análisis de las secuencias de los unigenes 6_F11, proteína inmunomoduladora de células T (TCP), 7_A04, subunidad beta del proteasoma (P beta), y 12_H09, proteína de maduración del proteasoma (PMP), buscando polimorfismo genético en poblaciones de mosca H.
DISCUSION Y CONCLUSIONES
De hecho, el análisis de secuencia de serina proteasa unigenes hace difícil distinguir entre parálogos y polimorfismos dentro de una población de moscas H. El silenciamiento del gen inhibidor de la elastasa produce un aumento significativo de la mortalidad a las 12, 24 y 36 h.hpi y ningún efecto sobre oviposición de moscas H. En las abejas, silenciar la expresión de VTG con ARNi afecta el comportamiento de desarrollo de las abejas obreras (Amdam et al., 2006; Marco Antonio et al., 2008).
La ubiquitinación es una modificación postraduccional realizada por una serie de enzimas que afectan la degradación, estabilidad, función y localización intracelular de proteínas proteasómicas (Sorokin et al., 2009). Además, puede ser necesario el silenciamiento simultáneo de otros genes de ubiquitinación para tener un efecto significativo sobre la mortalidad y la oviposición de H. Por ejemplo, silenciar UBQ en garrapatas causa mortalidad, disminución de la oviposición y reducción en la multiplicación de Anaplasma marginale en el intestino (de la Fuente et al., 2007c, Almazán et al., 2010).
El silenciamiento de las cadenas ligeras FER redujo significativamente la oviposición (6 veces en comparación con los controles), pero sorprendentemente, la mortalidad también se redujo en comparación con los controles. Sin embargo, basándose en la función esencial del proteasoma en las células eucariotas, no fue sorprendente observar una reducción de la oviposición en las moscas H. El silenciamiento de estos genes resultó en una mayor mortalidad y una menor oviposición, en comparación con el control, probablemente debido a una mayor susceptibilidad a infecciones persistentes. por patógenos resultantes del cambio en la respuesta inmune en H.
En este trabajo, y como se muestra en garrapatas (de la Fuente et al., 2005), el silenciamiento 5'-NUC da como resultado una alta mortalidad y una menor oviposición en comparación con el control. Mediante iRNA, se ha demostrado que algunos unigenes afectan la supervivencia y reproducción de H. La mayor expresión de genes de subunidades del proteasoma en hembras y los resultados obtenidos al silenciar estos genes, lo que reduce la puesta de huevos, indicarían que estos genes son importantes para la reproducción de h.
The role of HiTI, a serine protease inhibitor from Haematobia irritans irritans (Diptera: Muscidae) in the control of fly and bacterial proteases. Population dynamics of the horn fly, Haematobia irritans irritans (L.) (Diptera: . Muscidae) on Hereford cattle in Uruguay. Identification of protective antigens by RNA interference for control of the lone star tick, Amblyomma americanum.
Long-term study of the seasonal distribution of Haematobia irritans (Diptera: Muscidae) in central Argentina with a focus on winter fly abundance. Permethrin and Diazinon Resistance Study and Use of a Multiplex Polymerase Chain Reaction Assay to Detect Resistance Alleles in the Horn Fly, Haematobia irritans irritans (L.). Pathogenicity of three formulations of entomopathogenic fungi for the control of adult Haematobia irritans (Díptera: . Muscidae).
Impact of entomopathogenic fungus Metarhizium anisopliae on cattle naturally infected by mature Haematobia irritans in temperate Mexico. Diapause, pupation, sites and parasitism of the horn fly, Haematobia irritans, in southeastern Brazil. Efficacy of the ivomec SR bolus for controlling horn flies (Diptera: Muscidae) on cattle in South Texas.
Efficacy of entomopathogenic fungi in the control of eggs and larvae of the horn fly Haematobia irritans (Diptera: Muscidae). Distribution of horn flies on individual cows as a percentage of the total horn fly population. A procedure for evaluating horn fly, Haematobia irritans (L) pyrethroid resistance when exposed to pyrethroid residues on glass.
