Presencia de hongos y levaduras en muestras contaminadas por hidrocarburos de suelos en la playa Bahía Blanca - Ventanilla
Alejandro Alemán
a, Nayeli Apolinario
a,Nailea Bravo
a, Americo Escapa
a, Katherine Tovar
aa Facultad de Ciencias Ambientales Universidad Científica del Sur – Carr. Panamericana Sur km 19, Villa el Salvador.
RESUMEN
La contaminación de los suelos por hidrocarburos es un problema medioambiental que se produce por el mal manejo de los hidrocarburos, por tal razón se ha propuesto como una alternativa la aplicación de los hongos y levaduras para la remediación de los suelos contaminados. En estudios previos, se ha demostrado que los hongos del género Aspergillus degradaron el petróleo a un 85% en la Bahía de Amuay, Venezuela. En otro estudio, se evaluó el potencial de
Aspergillusy
Acinetobacter sp. para la biorremediación de suelos contaminados porhidrocarburos. Los autores determinaron que
Acinetobacter sp. fue más efectivopara la degradación de hidrocarburos. En este trabajo, se evaluó la presencia de hongos y levaduras en suelos contaminados por hidrocarburos en la playa Bahía Blanca de Ventanilla. Para ello, se tomó una muestra de 1 kg de suelo a una profundidad de 10 cm., luego se colocó en un recipiente a una temperatura de 4°C para su transporte. Posteriormente, la muestra se diluyó con 9 mL de agua peptona estéril y se agitó durante 10 minutos. Seguidamente, se tomaron 1 mL de la solución 10-1 y se transfirió al tubo marcado como 10
-2, repitiendo este proceso en secuencia para los demás tubos. Después, se seleccionaron tres tubos de ensayo con las diluciones consecutivas 10
-2, 10
-3y 10
-4. Luego, utilizando una micropipeta, se tomó con precisión 0.1 mL de la dilución 10
-4y se vertió cuidadosamente en el medio de cultivo presente en una caja Petri. Finalmente, se repitió para cada una de las diluciones restantes, es decir, para las diluciones 10
-2.En los resultados, se identificó la morfología macroscópica de hongos y levaduras como
Aspergillus, Fusarium, Cladosporium Resinae, Penicillium funiculosum y Candida albicans enla playa Bahía Blanca de Ventanilla.Se concluyó que el hongo que presentó mayor potencial biodegradador de hidrocarburos fue la especie Candida albicans con un 86.25%, debido a sus propios mecanismos que utilizan para degradar el hidrocarburo y se requiere realizar más investigaciones para comprender mejor la actividad de proteínas, las rutas metabólicas y las enzimas producidas por los hongos y levaduras.
Palabras clave: Biorremediación, hongos, levaduras, hidrocarburos, suelos contaminados.
ABSTRACT
Soil contamination by hydrocarbons is an environmental problem caused by poor management of hydrocarbons; therefore, the application of fungi and yeasts for the remediation of contaminated soils has been proposed as an alternative. In previous studies, it has been shown that fungi of the genus Aspergillus degraded 85% of the oil in the Bay of Amuay, Venezuela. In another study, the potential of Aspergillus and Acinetobacter sp. for bioremediation of hydrocarbon contaminated soils was evaluated. The authors determined that Acinetobacter sp. was more effective for hydrocarbon degradation. In this work, the presence of fungi and yeasts was evaluated in hydrocarbon-contaminated soils at the Bahía Blanca beach in Ventanilla. A sample of 1 kg of soil was taken at a depth of 10 cm and placed in a container at a temperature of 4°C for transport. Subsequently, the sample was diluted with 9 mL of sterile peptone water and shaken for 10 minutes. Next, 1 mL of the 10
-1solution was taken and transferred to the tube labeled 10
-2, repeating this process in sequence for the other tubes. Then, three test tubes with consecutive dilutions 10
-2, 10
-3and 10
-4were selected. Then, using a micropipette, 0.1 mL of the 10-4 dilution was accurately taken and carefully poured into the culture medium present in a Petri dish. Finally, it was repeated for each of the remaining dilutions, that is, for the 10-2 dilutions.In the results, the macroscopic morphology of fungi and yeasts such as
Aspergillus, Fusarium, Cladosporium Resinae, Penicillium funiculosum and Candida albicans was identified in the Bahía Blanca beach ofVentanilla. It was concluded that the fungus that presented the greatest hydrocarbon biodegrading potential was the
Candida albicans species with86.25%, due to its own mechanisms used to degrade the hydrocarbon, and further research is required to better understand the activity of proteins, metabolic pathways and enzymes produced by fungi and yeasts.
Keywords: Bioremediation, fungi, yeasts, hydrocarbons, contaminated soils.
1. INTRODUCCIÓN
En la actualidad, aproximadamente un tercio del suministro global de petróleo proviene de más de 15,000 plataformas petrolíferas marinas a nivel mundial (Pulido, 2022). A lo largo de varias décadas, se han registrado incidentes de vertidos de petróleo, principalmente durante las operaciones de descarga en las refinerías. Estos derrames pueden tener consecuencias significativas en las playas debido a la interacción del petróleo con el entorno marino y la morfología costera. El petróleo liberado forma una capa en la superficie del agua, extendiéndose rápidamente por inercia, gravedad y tensión superficial. Las corrientes pueden transportar y estirar la mancha de petróleo, aumentando así su alcance y la posibilidad de contaminar playas (Goveas et al., 2022).
Por consiguiente, resulta crucial tomar medidas para reducir el impacto ambiental en los océanos y las playas. En los últimos años, han surgido diversas tecnologías para abordar la contaminación por hidrocarburos (Barnes et al., 2018). Una estrategia prometedora implica el uso de microorganismos, cuya función es fundamental en los ecosistemas (Madigan et al., 2021). La diversidad y adaptabilidad de estos microorganismos han despertado un interés creciente en microbiología y biología ambiental. Aunque diversos géneros de hongos, como Aspergillus, con aplicaciones industriales, Agaricus, con variedades comestibles, y Penicillium, conocido por la producción de antibióticos, se han identificado en el suelo (Góngora et al., 2022), aún no se ha llevado a cabo una investigación exhaustiva en Perú sobre la diversidad de hongos y levaduras en suelos costeros y su posible relación con la contaminación por hidrocarburos.
Esta investigación tiene como objetivo llenar este vacío de conocimiento y proporcionar datos valiosos sobre la ecología de estos microorganismos en entornos costeros afectados. Se llevará a cabo una revisión bibliográfica y el análisis de muestras mediante el aislamiento, la identificación y la caracterización de especies fúngicas y levaduras en suelos con presencia de hidrocarburos en Ventanilla. Además, se evaluará su potencial para la restauración ambiental a través de procesos de
biorremediación, basándose en informes previos. Este enfoque busca contribuir con información innovadora sobre la ecología microbiana, con el fin de diseñar futuros planes de saneamiento ambiental en playas afectadas, incluida la zona de estudio.
2. ANTECEDENTES
Medina et al. (2014), en su investigación titulada "Biodegradación de petróleo por microorganismos autóctonos en suelos contaminados provenientes de la bahía de Amuay del Estado Falcón", llevaron a cabo el aislamiento e identificación de tres especies autóctonas de hongos pertenecientes al género Aspergillus, a saber: Aspergillus Níger, Aspergillus Flavus, Aspergillus Terreus. Esto se logró mediante la extracción utilizando la técnica de flotación en aceite mineral modificada, seguida de la inoculación en medios de cultivo de Saboraud Agar para su análisis macroscópico y posterior análisis microscópico mediante el método de Ridley. El objetivo era estudiar la capacidad de biodegradación de estos hongos en suelos contaminados de la Bahía de Amuay, y los resultados indicaron una remoción del 85% de petróleo.
Por otro lado, Cifuentes & Espinosa (2008), en su estudio titulado "Aislamiento e identificación de hongos filamentosos de muestras de suelo de los Páramos de Guasca y Cruz verde", llevaron a cabo el aislamiento e identificación de hongos filamentosos originarios de los Páramos de Guasca y Cruz Verde. El propósito de este trabajo era enriquecer el conocimiento sobre la ecología de los páramos en Colombia. Se emplearon tres técnicas: dilución en placa, siembra directa en suelo y lavado de suelo. Los géneros de mayor incidencia fueron Aspergillus y Penicillium, entre otros.
En la investigación realizada por Maamar et al.
(2020), se evaluó el potencial de biorremediación fúngica del petróleo en el medio marino. Se recolectaron 84 hongos filamentosos de muestras de agua de mar, y se analizó su capacidad para degradar el petróleo crudo. Entre los 12 aislados capaces de utilizar el petróleo crudo como única fuente de carbono, se identificaron cuatro como los más prometedores para la biodegradación. Además,
se examinó la capacidad de producción de biosurfactantes, y los cuatro aislados más prometedores resultaron ser los mayores productores de biosurfactantes. Estos hallazgos sugieren que estos hongos podrían ser una opción efectiva para la biorremediación del petróleo crudo en el medio marino mediante procesos de bioaumentación y bioestimulación.
En el estudio sobre la producción de inóculo de Pleurotus ostreatus para la biorremediación de suelos contaminados con hidrocarburos de petróleo, se midió el crecimiento de Pleurotus ostreatus en medio sólido, cultivado en granos de trigo y cebada para la producción de inóculo fúngico. Luego, se evaluó su crecimiento en suelos contaminados con crudo de petróleo. Los resultados mostraron un mayor crecimiento de micelio en el inóculo primario preparado con trigo, con un crecimiento de 1210.40 m/g. En la producción de inóculo secundario, se alcanzó un crecimiento de 106,000 cm/g y 1053.60 m/g en trigo y cebada, respectivamente. Se concluyó que los tratamientos con cebada mostraron una mayor colonización en el suelo, sin aumentos significativos al agregar suplementos de torta de soya y aserrín (Sifuentes, 2014).
En la investigación sobre Aspergillus y Acinetobacter sp para la biorremediación de suelos contaminados por hidrocarburos, se obtuvo una muestra de suelo contaminado por petróleo, se evaluaron parámetros como pH, conductividad eléctrica, materia orgánica y extracción de HTPs. La muestra se dividió en dos partes, una inoculada con Aspergillus levadura y la otra con Acinetobacter Sp bacteria. Se monitoreó semanalmente durante 6 semanas, y los resultados indicaron que el Aspergillus levadura aumentó el pH más que el Acinetobacter Sp bacteria. La conductividad eléctrica aumentó en la muestra con Acinetobacter Sp, mientras que la materia orgánica disminuyó más en la muestra con Aspergillus. Se concluyó que Aspergillus disminuyó en comparación con la muestra inicial, mientras que Acinetobacter Sp bacteria logró disminuir (Campos, 2020).
3. METODOLOGÍA 3.1. Materiales:
Agar
Tubos de ensayo
Asa de Digralsky
Jeringa de 1Ml
Agua peptonada
Placas Petri
Gradilla
Mechero
3.2. Recolección de la muestra:
Con el uso de guantes de guantes desechables y una pala esterilizada, hacer un corte en V en el suelo a una profundidad aproximada de 10 cm de una zona de Playa Bahía Blanca - Ventanilla. Recolectar varios puntos de muestreo donde se sospeche la presencia de hidrocarburos, homogeneizar todas las muestras. Recoger 1 kg de suelo y sellar en una bolsa hermética estéril y etiquetar con los datos correspondientes. Utilizar un recipiente adicional que contenga temperatura
aproximada de 4°C para su transporte (Kremer, 2019)
3.3. Preparación de la suspensión inicial (10-1):
La muestra, tomada a una profundidad de 10 cm en una zona de Playa Bahía Blanca - Ventanilla debido a la presencia de hidrocarburos, se diluyó utilizando 90 mL de agua peptona estéril. A continuación, se empleó un agitador magnético durante 10 minutos para lograr una homogeneización completa. Posteriormente, se etiquetaron los y 10-3.
Finalmente, se colocaron las cajas Petri preparadas en un lugar con temperatura ambiente y luz tenue para la incubación. Este procedimiento permitirá el crecimiento de colonias microbianas en las placas de cultivo, lo que facilitará su posterior análisis y estudio.
tubos de ensayo con las designaciones 10-2, 10-
3, 10-4, y similares, cada uno conteniendo 9 mL de agua peptona estéril. Utilizando una micro pipeta, se extrajo una alícuota de 1 mL de la solución 10-1 y se transfirió al tubo marcado como 10-2, repitiendo este proceso en secuencia para los demás tubos. Este método asegura la preparación adecuada de diluciones que
permiten futuros análisis microbiológicos de la muestra de tierra.
3.4. Siembra en medio Agar:
Se seleccionaron tres tubos de ensayo con las diluciones consecutivas 10-2, 10-3 y 10-4. Luego, utilizando una micropipeta, se tomó con precisión 0.1 mL de la dilución 10-4 y se vertió cuidadosamente en el medio de cultivo presente en una caja Petri. Con el asa de Digralsky y cerca del mechero, se distribuyó de manera uniforme la muestra en el medio de cultivo, asegurando una dispersión homogénea. Este proceso se repitió para cada una de las diluciones restantes, es decir, para las diluciones 10-2.
3.5. Morfología de las colonias a nivel Macroscópico
Para la descripción de la morfología de las colonias a nivel macroscópico en las placas petri se consideraron distintos aspectos como su; tamaño (puntiforme,grande o pequeño), borde (entero, rizoide o filamentoso), transparencia (opaco o transparente), brillo, color (pigmentadas o no pigmentadas), textura (lisa o rugosa), elevación (plana, convexa,elevada o umbilicada) y finalmente su consistencia (suave, dura o mucoide).
Las colonias de hongos macroscópicos se observaron en placas de Petri con atención a su color, forma, elevación, márgenes y superficie.
Para las observaciones microscópicas, se utilizaron dos métodos de preparación de secado en punto crítico y liofilización. Hay varios métodos como el de conservación de agua por Castellani y capa de aceite mineral que garantizan la preservación adecuada de hongos durante largos períodos de tiempo, asegurando viabilidad, pureza y estabilidad morfológica.
Además, la morfología de las colonias a nivel macroscópico de hongos es una herramienta importante que sirve para comprender el comportamiento de los hongos, su clasificación y determinar el diagnóstico de las enfermedades fúngicas.
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 4.1. Descripción general: Placas Petri
Después de realizar el proceso de siembra
en las placas petri en diferentes niveles de
concentraciones de muestra en agua
peptonada (10-1, 10-2, 10-3, 10-4),
obtuvimos la presencia de diversidad de
hongos como
Aspergillus, Fusarium, Penicillium, Cladosporiumy
Candida albicansen suelos contaminados con
hidrocarburos en la playa Bahía Blanca en
Ventanilla. Mediante una revisión
bibliográfica realizada previamente se
afirma que los hongos
aspergilluses un
género filamentoso que se caracteriza por
su capacidad de producir esporas en formas
de cadena llamadas conidios. Además,
también es conocido por su capacidad de
degradar compuestos orgánicos,
incluyendo hidrocarburos (Arbulú et al.,
2020). Con respecto al género Fusarium se
encontró que posee cepas las cuales pueden
ser patógenas para las plantas, causando
enfermedades como marchitez y pudrición
de raíces. Estos hongos también pueden
producir micotoxinas, compuestos tóxicos
que pueden afectar la salud humana y
animal, asimismo tiene capacidad de
degradar hidrocarburos totales de petróleo
presentes en suelos (Oliva, R. 2018). Por
otro lado, según la información recopilada,
los hongos Penicillium, se caracterizan por
su capacidad de producir penicilina, un antibiótico ampliamente utilizado en medicina. Estos hongos son comunes en el suelo y pueden tener diferentes colores, como azul, verde o blanco. Algunas especies de
Penicillium también puedenproducir micotoxinas (Fernandez, T.
2018). De la misma manera la especie de levadura candida albicans, es común en el suelo y en el tracto gastrointestinal de los seres humanos y otros animales, se afirma que es capaz de crecer en una amplia variedad de condiciones y pueden formar colonias blancas o cremosas en las placas de petri (Sandoval et al., 2017).
4.2. Aspergillus
El género Aspergillus tiene colonias que crecen rápidamente y producen muchas esporas, y tienen una apariencia variada que puede ser plana, ligeramente arrugada, aterciopelada o con superficies azonadas o radiadas (Hidalgo, A. 2022). Los colores también son variados, desde blanco, verde azulado, verde limón, verde grisáceo, amarillo, marrón oscuro o negro (Cardosa, J. 2019). Los conidios tienen un crecimiento basipétalo y pueden ser uniseriados o biseriados, y su coloración varía entre hialina, verde, anaranjado y negro (Okayo et al., 2020).
Para la identificación del hongo Aspergillus una de las técnicas más utilizadas es la técnica de recuento en placa, la mayor parte de las especies se desarrollan sobre el agar Czapek- levadura (Cardoza, J. 2019). Asimismo, se pueden utilizar técnicas de PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) para identificar su presencia en las muestras. Estas técnicas permiten amplificar el ADN del hongo y detectarlo mediante la utilización de sondas específicas (Abdelghany et al., 2017).
En cuanto a los factores que influyen la presencia y actividad de los hongos y levaduras, esto se debe al derrame de petróleo que altera
su estructura de su composición reduce la oxigenación, incrementa la concentración de materia orgánica de carbono, altera la capacidad de intercambio de iones y acidifica el suelo. Estas condiciones pueden favorecer el aumento de los hongos en el suelo (Camacho, K. 2020). Los hongo presentes en los lugares contaminados son utilizados para la remediación, ya que tienen ciertas ventajas con respecto a la bioadsorción y la biodegradación debido a su capacidad de tolerar al pH ácido que están presentes en las aguas residuales de las refinerías (Al - Hawash et al., 2019) . Uno de los hongos más estudiados y encontrados en los sitios contaminados, es Aspergillus sp que muestra una capacidad de bioadsorción excepcional contra los tóxicos del petróleo, de un ambiente contaminado por las industrias petroleras y las aguas residuales de las refinerías (El-Bondkly, A., & El-Gendy, 2022).
Asimismo, las especies de Aspergillus son más activas que otras especies hacia los hidrocarburos, produciendo la mayor biomasa seca. (Benguenab & Chibani, 2021). En un estudio de degradación de hidrocarburos por Aspergillus niger utilizando petróleo crudo en 6 días, se determinó el grado de degradación de hidrocarburos donde el petróleo crudo tuvo el mayor porcentaje de degradación, 52,01%
(Hassaine & Bordjiba, 2019). Asimismo, en otra investigación Aspergillus ustus eliminó el el 30,43% del petróleo crudo, este hongo acumuló una alta biomasa en medio líquido con todos los aceites de petróleo en un tiempo de (t 1/2 = 46,21 días) (Benguenab & Chibani, 2021). Igualmente, Al-Dhabaan (2019), en su estudio determinó que la cepa de Aspergillus niger, demostró tener la mayor capacidad de degradación de petróleo con un porcentaje del 58%. Usando Aspergillus niger por sí solo remedia el suelo contaminado con petróleo crudo mejor que el suelo contaminado con petróleo crudo tratado. Por lo tanto, en un sitio de derrame contaminado con petróleo crudo, Aspergillus niger sería una mejor opción de bioestimulante (Al-Dossary et al., 2021).
Finalmente, en cuanto a las condiciones óptimas para el crecimiento del hongo Aspergillus, este puede resistir condiciones de acidez altas con un pH entre 2-9, siendo su pH óptimo entre 5-6 (Gutierrez & Dioselinda, 2017). La ubicuidad de Aspergillus se debe a que posee la capacidad de crecer en diferentes temperaturas sobre sustratos con un variado
contenido de humedad (Avilés & Lozada, 2018). El intervalo de temperatura para el crecimiento varía desde 0-5°C para Aspergillus glaucus hasta 50-55°C para Aspergillus fumigatus, siendo el propicio entre 30-33°C para la mayoría de las especies (González et al., 2022). Para una mayor eficacia Benguenab &
Chibani (2021), indican que la biorremediación debe ser llevada a cabo por organismos autóctonos de zonas contaminadas por petróleo.
4.3. Fusarium
En el estudio llevado a cabo en la playa Bahía Blanca de Ventanilla, se encontró la presencia de Fusarium en muestras de suelo contaminados por derrames de petróleo.
Mediante el uso de técnicas microbiológicas estándar y utilizando agar como medio de cultivo, se pudo detectar la presencia de este hongo. Fusarium mostró una apariencia vista macroscópica caracterizada por tener colonias de grán tamaño, borde rizado, color amarillo casi en su totalidad, textura rugosa, elevación umbonada y con textura suave.
La colonia de hongos Fusarium bajo sus condiciones ideales es capaz de desarrollarse de mejor manera. Condiciones de 28°C, salida ligeramente alta, pH entre 7 - 9 y humedad ligeramente alto favorecen el crecimiento de las colonias de hongos Fusarium (Marquez- Badillo, 2017). Por otro lado, los niveles bajos de N y P y altos de K aumentan el crecimiento de estas colonias. (Castro et al., 2018). Estos datos se compraron con un estudio realizado por Marquez, A. En el 2019 en donde se analizó la capacidad de extracción de Fusarium en un suelo con humedad 7.0 ± 0.6, pH 8.1 (medianamente alcalino), los niveles de materia orgánica en 1.0 aumentaron la capacidad de remediar suelos contaminados con HTP.
Según Castro, D., 2019 afirma que los hongos Fusarium presentes en suelos contaminados por hidrocarburos pueden ser utilizados para su
remediación. Se analizan propiedades como capacidad de degradación ya que contienen enzimas capaces de descomponer los hidrocarburos en compuestos más simples y menos tóxicos; por otro lado la tolerancia a situaciones adversas como condiciones ambientales desfavorables. Sin embargo es importante tener en cuenta que la efectividad de los hongos Fusarium en la remediación de hidrocarburos puede variar según la especie de hongo, el tipo de hidrocarburo y las condiciones ambientales específicas.
Los datos encontrados expresan que mediante cepas 4 fúngicas las cuales se denominaron HBG, M1H5, HBC7 y HBC9. Evaluadas en función de su actividad enzimática, lo cual permitió seleccionar a las dos cepas que presentan mayor actividad ligninolítica.
Obteniendo como como resultado mayor porcentaje de remoción de HTP en 12%
(Marquez, A., 2019)
Por otro lado analizando el efecto de remoción de hidrocarburos usando una cepa ZH - H2 Fusarium sp. en diferentes condiciones se afirma que el mejor rendimiento de eliminación de HMW - PAH se logró con una combinación de almidón y ácido húmico como fuentes de carbono. Obteniendo la remoción más alta de 54,63% en BaP. (Zhang et al., 2023).
4.4. Penicillum
Diversos estudios mencionan que una de las especies más aisladas para analizar su potencial de biorremediación en suelo contaminados por hidrocarburos en ambientes costeros es Penicillium, lo cual concuerda con nuestros resultados al identificarlo en nuestra muestra de suelo marino. Se identificó sus características macroscópicas detallando que cuenta con una superficie blanca aterciopelada, la cual se encuentra cubierta por esporos de un color verde azulado, al reverso anaranjado a café y
cuenta con una estructura conidióforo, características propias de la especie Penicillium funiculosum (Cifuentes y Espinosa,2008). Para poder clasificar a la especie de manera más específica se realiza una observación microscópica en la cual se observa la posición de las ramificaciones que emergen de los conidióforos denominados verticilos que permiten identificar diferentes especies del género como: monoverticillata, asimétrica,
biverticillatasimétrica y
poliverticillat.(Guzmán, 1977). Además, para su descripción se debe usar la taxonomía existente propuesta por Pitt & Hocking (2009) y Klich & Pitt (1998). Otro método utilizado es el análisis de 18S RNA de su caracterización genética. (Rodriguez et al., 2016).Este hongo se desarrolla con mayor facilidad en Agar Extracto de Malta, Extracto de levadura y CzA.(Cifuentes y Espinosa,2008).
El género penicillium se encuentra en mayor distribución geográfica, sus esporas están en el aire y en el suelo, se establecen en muchos ambientes y se manifiestan en diversos procesos biológicos, como en suelos contaminados por hidrocarburos. En un estudio realizado en México sobre un suelo Gleysol- mólico contaminado con 4,0 x 105ppm de HTP, se identificó el género Penicillium sp. , el cual tuvo un mejor crecimiento en medio Nitrofoska Azul, pH de 3.5 y una temperatura de 35°C en un periodo de 20 días con 4.28 x 106 UFC mL- 1(José Gabriel et al., 2011), otro estudio ex situ realizado en suelo contaminado por hidrocarburos de Magallanes se estudió el crecimiento potencial de este género en estructuras de petróleo diferentes como el n- dodecano a 20 g L-1, teniendo un crecimiento de 14.67 ± 1.88 mm por hora.(Rodriguez et al., 2016). La especie requiere de una humedad relativa de 85-90%, crecen incluso a temperaturas bajo cero (-2C°), el pH y la temperatura son factores que influyen significativamente en el crecimiento de P.
verrucosum. Es importante destacar que tanto P. verrucosum como P. crustosum no logran crecer a una temperatura de 37ºC. La luz no afecta a los penicilios, ya que pueden esporular fácilmente en la oscuridad. Algunas especies, como P. aurantiogriseum y especialmente P.
roqueforti, tienen la capacidad de resistir altas concentraciones de CO2, lo que les permite colonizar granos en silos herméticamente sellados(Peréz et al., 202). Destacar que cada
especie presenta una curva diferente de crecimiento debido a factores estructurales y factores ambientales.
Con respecto a su nivel de degradación en un estudio realizado en un suelo franco limoso contaminado con 60 600 mg/kg-1 de una mezcla de hidrocarburos totales de petróleo (TPH), que comprende un 40% de hidrocarburos alifáticos (AH) y 21% de hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP), dentro los hongos que lograron desarrollarse está el género Penicillium funiculosum en agar PDA y sabouraud, con TPH en cultivo líquido para su aclimatación,se logró una degradación del 45% de los TPH debido a que utiliza pireno como fuente de energía(Mancera-López et al., 2008). Por otro lado un trabajo de investigación estudió el potencial biodegradador de las especie P. lilacinum y P. chrysogenum para una muestra de lodo de petróleo pesado obtenido de oleoducto de un pozo petrolero ubicado en Sinkiang, China, la muestra de lodo estaba a un pH de 7,79 y una concentración de TPH de 269,2 g/Kg-1, la tasa de degradación obtenidas del petróleo ligero fueron 33,81 %( P.
lilacinum) y 24,01% (P. chrysogenum) y para el lodo de petróleo fueron 14,04% (P.
lilacinum) y 10,06% (P. chrysogenum) (Yang et al., 2023).
4.5. Cladosporium
En el presente estudio realizado en la playa Bahía Blanca de Ventanilla, se identificó la presencia de Cladosporium a partir de muestras de suelos contaminados con hidrocarburos.
Mediante técnicas microbiológicas estándar y uso de agar nutritivo como medio de cultivo se detectó la presencia de este hongo. Este hongo presentó una morfología macroscópica caracterizada por colonias de gran tamaño, bordes enteros, color verde mate, textura rugosa, elevación acuminada y consistencia suave.
La literatura evidencia que los hongos, y específicamente aquellos del género Cladosporium, tienen un rol importante en la biorremediación de playas y suelos contaminados por hidrocarburos del petróleo (Góngora et al., 2022). Este hongo posee vías metabólicas y una versátil dotación enzimática (oxidasas, peroxidasas, citocromos) que, mediante reacciones de oxidación, reducción y ruptura de anillos aromáticos pueden degradar tanto compuestos alifáticos como aromáticos presentes en el crudo (Barnes et al, 2018). Tal capacidad biodegradativa ha sido ampliamente reportada previamente (Maamar et al, 2020).
De igual manera Hamad et al. (2021) probaron el uso de consorcios de hongos aislados de suelos contaminados con hidrocarburos en Egipto. Entre las especies evaluadas se encontraba Cladosporium, demostraron que los hongos "exhibieron un alto potencial significativo para degradar los HAP " (Hamad et al., 2021,). Esto respalda la idea de emplear especies de hongos como Cladosporium, en estrategias de biorremediación.
Sumado a lo anterior específicamente en un estudio realizado por Oh, Ki-bong , profesor de la universidad de Seul, se evaluó la capacidad de esta especie fúngica para degradar los hidrocarburos presentes en crudo de petróleo.
Los resultados mostraron que Cladosporium Resinae tiene una alta tasa de degradación de los hidrocarburos totales de 60% de la concentración (11ml de hidrocarburos en 100ml de solución salina) respecto a la muestra control. Esto se debe principalmente a la producción de enzimas extracelulares como lignina per oxidadas, que pueden romper las cadenas de carbono largas.
En otro estudio, creado por Olivier Potin (2012) se estudió la habilidad de una cepa fúngica de la especie Cladosporium sphaerospermum, previamente aislada de un suelo contaminado con HAPs, para degradar estos compuestos.
Los resultados demostraron que Cladosporium sphaerospermum fue capaz de degradar en promedio un 23% de los HAP presentes, incluyendo aquellos HAP de alto peso molecular, luego de 4 semanas de incubación.
Además, en experimentos con cultivos líquidos, la cepa fúngica degradó rápidamente hasta un 18% del benzo(a)pireno, uno de los HAP más recalcitrantes.
Factores abióticos como temperatura, pH, humedad, salinidad y disponibilidad de nutrientes impactan fuertemente sobre la fisiología de Cladosporium determinando su óptimo crecimiento y actividad metabólica en el ambiente. Por ejemplo, temperaturas de 25- 30°C, salinidad moderada, pH entre 6-8 y adecuada humedad favorecen su óptimo crecimiento (Barnes et al., 2018). Asimismo, requiere disponibilidad de fuentes de nitrógeno, fósforo y oligoelementos para que se desarrolle de manera óptima (Maamar et al., 2020). De igual manera en el estudio realizado por Oh,Ki- Bong se determinó que las condiciones óptimas de crecimiento y degradación fueron a pH 6,0 y a una temperatura de 28 a 30°C" . Esto concuerda con el conocimiento sobre los requerimientos de Cladosporium para una actividad metabólica máxima. Por lo tanto, en una posible aplicación para fitorremediar playas contaminadas, es esencial monitorear y ajustar estas condiciones ambientales.
4.6. Candida
En el presente estudio realizado en la playa Bahía Blanca de Ventanilla, se identificó la presencia de Candida albicans a partir de muestras de suelos contaminados por derrames de petróleo (Sandoval et al., 2017). Este hongo presentó una morfología macroscópica caracterizada por colonias grandes, bordes ondulados, color blanco, textura rugosa, elevación convexa y consistencia suave (López et al., 2020)
La literatura evidencia que la especie Candida albicans es una levadura comensal que vive en el cuerpo humano de forma natural, pero puede causar candidiasis en hospederos susceptibles (López et al., 2016). La especie de Candida albicans, se desarrolla en medios de cultivo con agar peptona, dextrosa, maltosa o sacarosa, las colonias muy pequeñas se observan en un lapso
de 24 a 36 horas con el agar Sabouraud y miden 1,5 a 2 mm de diámetro, se caracterizan por presentar una coloración blanca, pero adquieren un color crema o requemado en el transcurso de su ciclo vida (Tercero et al., 2017).
Además, se ha demostrado que, en la investigación sobre la evaluación de la calidad sanitaria del agua de las playas turísticas del Caribe Norte en Colombia, se identificó la presencia de la levadura Candida albicans en el agua y se evaluó en el laboratorio donde se utilizó el agar papa dextrosa y se determinó que la presencia de los hongos del género Candida producen enfermedades como infección, otomicosis, esofagitis (Zamora & Delgado, 2019). En otra investigación, se obtuvieron cepas de Candida albicans y fueron sembradas en 5 placas Petri rotuladas con el medio de cultivo el agar saboraud, luego se disolvió el aceite esencial de Cocos nucifera (coco) con dimetil sulfoxido a las concentraciones de 25%
y 50% y 100% En los resultados, se determinó que el aceite no demostró un efecto anti fúngico sobre las cepas de Candida albicans , sin embargo el control de clorhexidina al 2%
demostró eficacia anti fúngica (Santos, 2018).
Cabe resaltar, que hay varios métodos para identificar la presencia de levadura Candida albicans, como el método de referencia de micro dilución en caldo que sirve para determinar la sensibilidad de las levaduras de Candida spp. y permite la comprobación de aquellas levaduras que pueden fermentar a la glucosa (López et al., 2016). Otros métodos propuestos incluyen el uso de medios diferenciales como el agar GC Saboraud BD / medio CHROMagar para Candida biplaca, eta conformado por sustratos cromogénicos que sirve para el aislamiento e identificación selectivo de levaduras de Candida albicans, C.
tropicalis y C. krusei a partir de muestras clínicas. (Rahn, 2016). Otro método es la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), es el más conocido, se basa en biología molecular y sirve para la identificación de especies de hongos, es un método rápido y seguro que se puede utilizar para identificar levaduras (Sanchez et al., 2011).
Con respecto a los factores ambientales, las levaduras realizan la degradación de hidrocarburos y estos organismos tienen la capacidad de adaptarse a condiciones como pH, temperatura y niveles de contaminantes
(Dominguez et al., 2018). La especie Candida albicans se desarrollan "in vitro" en los medios de cultivo y en condiciones de aerobiosis a un pH que varía entre el rango de 2,5 y 7,5, mientras la temperatura oscila entre el rango de 20°C y 38°C (Rojas, 2016). El desarrollo de la especie se puede observar después de la siembra entre 48 y 72 horas. Las levaduras de menor patogenicidad, se desarrollan a una temperatura de 37°C, mientras las levaduras más patógenas se desarrollan a una temperatura que varía entre el rango de 25°C y 37°C.
Además, se ha demostrado que las levaduras como Candida, Cryptococcus, Rhodotorula, Hanseniaspora y Saccharomyces demuestran la capacidad de adaptación y crecimiento en la Antártida (Dominguez et al., 2018).
El pH óptimo para las levaduras varía entre el rango de 7,4 - 7,8 en la biodegradación de hidrocarburos, otro factor es la humedad del suelo que se considera un factor importante, ya que puede afectar la biodegradación de contaminantes (Soledad, 2014). Por ello, el nivel óptimo de humedad para la biodegradación depende de varios factores como las propiedades del agua, el tipo de contaminación y la biodegradación (Soledad, 2014). En el método de CHROMagar para la especie Candida se establece una temperatura óptima de 30 ± 1 ◦C, sin embargo, en los aislamientos y afenotipificados se almacenan en agua estéril a temperatura ambiente y en el método de PCR en la fase inicial de desnaturalización de la levadura se realiza a una temperatura de 96 ◦C (Sanchez et al., 2011).
Con respecto a su efectividad de remoción de hidrocarburos por la presencia de la levadura Candida albicans se ha demostrado que en la investigación realizada en la Ciudad de San Luis Potosí, México, se obtuvieron las muestras de diferentes suelos contaminados, luego se almacenaron en hielera y se trasladaron al laboratorio, donde la especie Candida albicans se aisló y se desarrolló en un 1 mL de petróleo como fuente de carbono mediante la técnica colorimétrica que se basa en la reducción del componente 2,6 diclorofenol indofenol (DCPIP) y se concluyó que Candida albicans presenta la capacidad para degradar el aceite casero nuevo y usado en un 79 y 88% (Tovar et al., 2023).
Según estudios, las características que permiten la degradación de hidrocarburos mediante la especie Candida Albicans es la eficiente actividad enzimática y el proceso de alcohol oxidasa en la fracción citosólica en los diferentes hidrocarburos (Cardenas et al., 2011). En otra investigación, en India se utilizó la levadura Candida Albicans para la biorremediación de agua contaminada por el colorante Crisofenina GX. La especie Candida Albicans, utiliza el medio nutritivo que está conformado por colorantes y los utiliza como fuente de carbono y energía, también se obtuvo la decoloración por la absorbancia de los sobrenadantes a través del espectrómetro UV- vis. Se concluyó, que Candida Albicans logró la degradación de Crisofenina GX en un 86,25
% en aguas residuales (Mukkera et al., 2022).
Según estudios, la especie Candida Albicans presenta un gran potencial para la producción de lipasas de LIP2 y LIP6 que actúan en la absorción del aceite debido a su condición metabólica que está conformada por enzimas que hidrolizan los ácidos grasos (Cáceres, 2019).
4.7. Porcentajes de degradación
En la tabla, se puede observar el porcentaje de degradación de hidrocarburos, siendo el de mayor porcentaje la especie de levadura Candida albicans con un 86.25% y el que presentó menor porcentaje es Penicillium lilacinum con 33.81% , según los autores (Dominguez et al ., 2018), mencionan que el porcentaje de degradación es diferente en cada especie, debido a las características metabólicas, que les permite sobrevivir y fitorremediar sitios contaminados principalmente compuestos de petróleo, compuestos aromáticos y de alto peso molecular. Esto también está evaluado por los autores (Contreras y Carreño, 2018), señalan que la supervivencia de la levadura y los hongos dependerá de sus características metabólicas, ya que se va atribuir al hidrocarburo como fuente de carbono. Sin
embargo, los autores (Ortiz y Carrara, 2017), señalan que la proliferación no depende mucho de sus características metabólicas, si no más de las condiciones ambientales principalmente de la temperatura el pH, con ello tienen garantizado su desarrollo.
5. CONCLUSIONES
Para la identificación de los hongos presentes en suelos contaminados por hidrocarburos en la playa de ventanilla, se sembró diluciones preparadas en el laboratorio de 10-1, 10-2, 10-3 y 10-4, permitiendo realizar un mejor análisis las diluciones 10-3 y 10-4 ya que se observan colonias más separadas para su identificación, sin embargo en las diluciones 10-1, 10-2 se observan más géneros de hongos de potencial interés, destacar que no se pudieron aislar colonias puras debido al tiempo de duración de la muestra.
Se lograron identificar 5 principales géneros de hongos como Aspergillus, Candida, Cladosporium, Penicillium y Fusarium, esto a nivel macroscópico y basándose principalmente en sus características morfológicas, la revisión bibliográfica propone un análisis microscópico de las estructuras de cada género para identificar las especies que nos permitirá enfatizar la identificación de especies con potencial hidrocarbonoclasta.
El hongo que presentó mayor potencial biodegradador de hidrocarburos fue la especie Candida albicans con un 86.25% y el que presentó menor porcentaje es Penicillium lilacinum con 33.81%, debido a sus propios mecanismos que utilizan para degradar el hidrocarburo, la Candida se han adaptado a vivir en condiciones ambientales muy diversas, pueden tolerar temperaturas extremas y pH ácidos o básicos. También son capaces de sobrevivir en presencia de contaminantes ambientales, como metales pesados o compuestos orgánicos tóxicos, por ello la especie Candida albicans se debe considerar para la biorremediación de la playa de Ventanilla.
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