Rhizobios, organismos fijadores de nitrógeno 1
Evolución de la fijación biológica de nitrógeno 2
La capacidad de nodular está restringida sólo a algunas familias dentro del clado Rosid I, por lo que se ha sugerido que la "aptitud para nodular" se adquirió sólo una vez en un ancestro común perteneciente a este clado (Gualtieri y Bisseling, 2000; Kistner y Parniske , 2002). Recientemente se ha dilucidado que el desarrollo de nódulos radiculares y la micorrización arbuscular (MA) que ocurre entre la mayoría de las plantas terrestres y hongos cigomitas del orden Glomales (Brundrett, 2002), comparten vías de señalización al menos durante las primeras etapas del establecimiento de la simbiosis (Albrecht et al., 1999; Kistner y Parniske, 2002) (Figura 1). La clonación de uno de los genes comunes necesarios para el desarrollo de ambas simbiosis, nork (receptor quinasa de nodulación) / symrk (quinasa similar al receptor de simbiosis), reveló que existen componentes de señalización comunes necesarios para el establecimiento de ambas simbiosis. (Endre et al., 2002; Stracke et al., 2002)).
Posteriormente se demostró que los genes de castor y pollux (anteriormente sym4 y sym23, respectivamente) eran esenciales para la aceptación de rizobios y micorrizas en la célula de la planta huésped (Imaizumi-Anraku et al., 2005). De esta forma, se observó el solapamiento de los programas genéticos necesarios para el establecimiento de ambas simbiosis (Albrecht et al., 1999; Kistner y Parniske, 2002). El vínculo entre las vías de señalización de estas asociaciones sugiere que durante la evolución de la simbiosis mediada por rizobios, se adoptó.
Los genes vegetales necesarios para establecer una simbiosis exitosa se analizarán más detalladamente en Resultados y Discusión - III. parte.
Etapas en la infección y nodulación 3
Estas moléculas, sintetizadas exclusivamente por rizobios, desempeñan un papel central en el establecimiento de la simbiosis rizobios-leguminosas. Según el modelo propuesto por Radutoiu et al. 2003), NFR1 y NFR5 formarían un heterodímero capaz de reconocer factores Nod con sus dominios LysM extracelulares y serían necesarios para desencadenar respuestas fisiológicas y celulares en la raíz de la leguminosa. Simultáneamente, las células corticales de la raíz se reactivan mitóticamente para formar el primordio del nódulo.
Varios polisacáridos de la superficie bacteriana son esenciales durante las primeras etapas de la simbiosis, junto con los factores Nod. La MPB tiene una composición de fosfolípidos y proteínas diferente a la de la membrana plasmática vegetal, característica que le conferiría funciones especializadas (Verma, 1992; Hernandez et al., 1995). Dentro del nódulo, se necesitan bajas concentraciones de oxígeno libre para proteger la actividad de la enzima Nitrogenasa.
En el parénquima nodular se describió la expresión de una nodulina (ENOD2), cuya presencia contribuiría a la construcción de la barrera de difusión de O2 (van de Wiel et al., 1990). La energía necesaria para la actividad de la enzima Nitrogenasa proviene de la fotosíntesis que se produce en las hojas.
Control de la planta sobre la infección 12
En la primera parte se analizará la regulación de la expresión del gen pgm de M.. Mediante microscopía de fluorescencia se podrá monitorizar el comportamiento del mutante lpsβ2::Gm-GFP de M.loti cuando interactúa con L. Niveles de expresión de los Componentes I (NifD) y II (NifH) de la enzima Nitrogenasa; así como Leghemoglobina (Lb) presente en nódulos de la cepa original, M.
Cinética de incorporación de la sonda fluorescente NPN en la cepa salvaje y dos mutantes tratados con PmB (A) y peróxido de hidrógeno (B). Como se puede observar en la Tabla 5, existe una clara dependencia del fenotipo de motilidad de la cepa mutante M. Se observan valores de νs(CH2) más altos que los de la cepa salvaje incluso por debajo de 30 °C.
Extractos de butanol del sobrenadante del cultivo de la cepa salvaje (1); y el mutante en el gen cgs (2) que sobreexpresa nodD FITA. Los genes de ricino y pollux (anteriormente sym4 y sym23, respectivamente) son esenciales para la absorción de rizobios y micorrizas en la célula de la planta huésped. Por lo tanto, se decidió analizar las diferencias en la expresión génica durante la interacción entre la cepa salvaje y los mutantes de M.
Por el contrario, sólo en el caso de la inoculación con el mutante M.loti cgs::Gm se observa un aumento de 3 veces en comparación con las raíces no infectadas. Por un lado, genes cuya expresión aumentada es independiente de la invasión bacteriana (como pal). Se caracterizó bioquímicamente el mutante en el gen pgm, que carece de actividad enzimática fosfoglucomutasa.
El protocolo seguido para la cuantificación de la actividad de ambas enzimas se detalla en (Ugalde et al., 1998). Los estudios se realizaron en la Facultad de Agricultura de la Universidad de Ehime, Japón.
Genes de bacterianos requeridos para una interacción simbiótica exitosa 13
Además, en caso de complementación con pPRC220, sólo se recuperó el 50% de la actividad Pgm en el mutante. La tabla muestra en detalle las características en cuanto a la actividad enzimática y producción de los diferentes polisacáridos bacterianos para el mutante M. Para ello, se introdujo en la cepa salvaje bv.
Para analizar la capacidad de la cepa mutante para producir LCO, fue necesario introducir el plásmido pMP604 en ella y en la cepa parental. Para el mutante en el gen pgm se pueden observar diferencias tanto en el número como en la intensidad de las bandas detectadas mediante autorradiografía. A raíz de estos resultados, se especuló que el cambio en la síntesis de factores Nod podría deberse a una menor concentración intracelular de ciertos sustratos en la cepa mutante.
Como se muestra en la Figura 8.A, la presencia de UDP-glucosa, UDP-galactosa, ADP-glucosa y UDP-GluNAc es evidente en los extractos correspondientes a la cepa salvaje. Por lo tanto, de este experimento se desprende claramente que la disminución de los niveles de UDP-GluNAc podría ser al menos una de las causas responsables de la disminución de la síntesis de factores Nod en la cepa M.
- Análisis de la importancia del Operón glucógeno de M. loti durante la simbiosis con Lotus spp
Participación simbiótica de componentes polisacarídicos de superficie o secretados
Los resultados obtenidos son consistentes con el hecho de que el cósmido pPRC220 que contiene una mutación polar en el gen glgB logró restaurar el 50% de la actividad de Pgm en el mutante A. Durante estos experimentos se observó que el PromoterI está activo dentro de la célula. invitado en . Estos resultados sugieren que la regulación de la expresión por PromoterI sería necesaria para la infección y replicación intracelular de M.
La síntesis de UDP-GluNAc no requiere Glu-1-P, y por tanto la enzima Pgm (Figura 2). Esta especulación estaría respaldada por el aumento en el número de nódulos y la tasa de nodulación observada con la adición exógena de β(1-2) glucanos cíclicos (Abe et al., 1982; Dylan et al., 1990; Bhagwat et al. . . . , 1992). Por un lado, favorecería la liberación del hilo de infección y la invasión de las células corticales, modificando la respuesta de defensa de la planta huésped (Dazzo et al., 1991; Perotto et al., 1994; Albus et al., 2001).
Los mutantes en este locus producen sólo R-LPS y la estructura nuclear es idéntica a la de la cepa salvaje. Producto de las incubaciones con extracto enzimático inactivado (A), extracto enzimático total de la cepa salvaje (B) y extracto enzimático total de la cepa mutante M. Considerando el análisis cuali-cuantitativo de azúcares detallado en el apartado anterior, la transferasa actividad del gen lpsβ1. Para este propósito, se evaluaron extractos de proteínas totales de la cepa original y M.loti lpsβ1::Gm en el R-LPS (aceptor) purificado de la cepa salvaje.
Como se muestra en el panel A de la misma figura, la transferencia de UDP-[14C]glucosa desde M. Sin embargo, la pérdida de función de la proteína Lpsβ1 se correlaciona con la ausencia del antígeno O en la molécula de LPS. Con base en resultados previos (Campbell et al., 2003), se realizaron estudios más detallados para determinar si los cambios estructurales en el LPS afectan el correcto desarrollo de la simbiosis entre M.
En el caso de la cepa salvaje, el tratamiento con este agente antimicrobiano no tiene ningún efecto, independientemente de las concentraciones utilizadas. Se observa una situación intermedia para el mutante en el gen lpsβ1, donde sólo el 50% de las células se recuperan después de la exposición a 40 mg/ml de PmB. La Figura 10 muestra la cinética de distribución de la sonda fluorescente N-fenil-1-naftilamina (NPN) para las tres cepas en presencia de polimixina B o peróxido de hidrógeno.
La exposición a concentraciones crecientes de EDTA provoca un aumento en la cinética de incorporación de NPN en la membrana de la cepa de tipo salvaje. Por el contrario, M. En este capítulo, fue evidente que el comportamiento de las cadenas acilo de LPS del tipo mutante M. También sugieren que la invasión de la bacteria a la célula huésped es necesaria para modificar la expresión de estos mensajeros.
Dentro de este grupo se encuentran genes que se inducen en las primeras etapas de la interacción M. Sin embargo, durante las últimas etapas de la simbiosis, la cinética y los niveles de expresión de los mensajeros probados son similares para las raíces de L. Como lo muestra el análisis de PCR en tiempo real. una inducción dramática (10 veces) de la expresión de este mensajero para las raíces de L.
Este comportamiento difiere de lo mostrado previamente en este trabajo para otros genes implicados en la respuesta de defensa de las plantas. Sin embargo, en los momentos tardíos de la nodulación, sus niveles de expresión se mantienen constantes en las raíces inoculadas con la cepa M. En la leguminosa huésped, se han descrito altos niveles de ROS durante las últimas etapas de la interacción S.
Se diseñaron oligonucleótidos específicos para que cada uno de los genes fuera mutagénico, teniendo en cuenta la secuencia disponible de la cepa M.
Perfil transcripcional de L. japonicus durante el desarrollo de nódulos efectivos e
El mutante en el gen cgs carece de actividad de glucano sintetasa cíclica y, por tanto, de GC en el espacio periplásmico.
