Universidad Nacional de General San Martín
Instituto de Investigaciones Biotecnológicas
TEMA
BRUCELLA ABORTUS
AUTORA
DIRECCIÓN
CODIRECCIÓN
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Tesis para optar al Título de
Doctora en Biología Molecular y Biotecnología de la Universidad Nacional de General San Martín
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“When I am working on a problem I never think about beauty.
I only think about how to solve the problem.
But when I have finished, if the solution is not beautiful, I know it is wrong”
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AGRADECIMIENTOS
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Brucella abortus
8 Parte de los resultados de esta Tesis han permitido la confección de los siguientes manuscritos:
“Ferrochelatase is present in Brucella abortus and is critical for its intracellular survival and virulence". 99 # # ' ( !" Infection and Immunity:;:<=89
“The bacterioferritin of Brucella abortus plays a role in iron homeostasis”.
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“Irr in Brucella abortus: characterization and studies on its regulation”.
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“Irr up-regulates siderophore biosynthesis in Brucella abortus”. # !" 99>? @
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INDICE
CAPITULO UNO: INTRODUCCIÓN
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BIBLIOGRAFIA 9=>
CAPITULO DOS: BIOSÍNTESIS DEL HEMO I:
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RESUMEN :
INTRODUCCIÓN J
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES K=8
Cepas, medios y condiciones de cultivo. Clonado y secuenciación de hemH.
Construcción del mutante hemH y de la cepa complementada. Cultivo de células HeLa y J774 y ensayos de infección. Ensayos de infección en ratones.
RESULTADOS 8=8>
Identificación, clonación e interrupción de hemH de B. abortus. La cepa B. abortus hemH exhibió auxotrofía para el hemo. La síntesis endógena del hemo es esencial
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para la replicación intracelular de B. abortus y para el establecimiento de la infección en ratones BALB/c.
DISCUSIÓN 8<=8:
BIBLIOGRAFÍA 8:=8K
CAPITULO TRES: BIOSÍNTESIS DEL HEMO II
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.
RESUMEN >9
INTRODUCCIÓN >
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES >=<9 Cepas, medios y condiciones de cultivoClonado y secuenciación. Construcción de mutantes. Expresión, purificación y detección por Western-blot de Irr. Detección de protoporfirina IX en sobrenadantes de cultivos de B. abortus. Ensayos de unión al hemo. Determinación del peso molecular de Irr. Detección de brucebactina en placa y en solución. Análisis por HPLC del 2,3-DHBA. Ensayo de sensibilidad al peróxido de hidrógeno. Ensayo de la actividad catalasa. Estimación del contenido del hemo. Ensayo de la actividad E-galactosidasa.
RESULTADOS <9=:>
Identificación, clonación e interrupción de irr en B. abortus. Acumulación de protoporfirina IX en la cepa de B. abortus 2308 IKEfecto del hierro sobre la regulación de irr. Ensayos de unión al hemo. Determinación del peso molecular de Irr. Efecto de Irr sobre su propia expresión. Detección de brucebactina por ensayo en placa. Análisis de los sideróforos secretados. Rol de Irr en la vida intracelular y en la virulencia de B. abortus. Determinación del contenido del hemo. Ensayo de la actividad catalasa y de la resistencia al estrés oxidativo de las cepas deB. abortus.
DISCUSIÓN :>=::
BIBLIOGRAFÍA ::=:J
CAPITULO CUATRO: BACTERIOFERRITINA:
- . $ B. abortus
:
RESUMEN :;
INTRODUCCIÓN J9=J
PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES J=J:
Cepas, medios y condiciones de cultivo. Clonado y secuenciación. Construcción de los mutantes. Curva de crecimiento en medio deficiente y suficiente en hierro.
Determinación de los sideróforos secretados. Ensayo de la actividad E- galactosidasa. Preparación y análisis de membranas totales de B. abortus cultivada en deficiencia y suficiencia del hierro. Marcado de proteínas sintetizadas en deficiencia de hierro. Ensayos de infección de células HeLa.
RESULTADOS J:=K:
Identificación, clonación, secuenciación e interrupción del gen bfr de B. abortus.
Crecimiento retardado de B. abortus bfr en medios deficientes en hierro. Detección de los sideróforos en las cepas de B. abortus. La ausencia de la bacterioferritina afecta la expresión del operón dhbCEBA. Efecto de la osmolaridad sobre la producción de los sideróforos. La ausencia de la bacterioferritina afecta el patrón de expresión proteica de B. abortus cultivada en deficiencia de hierro. Patrón diferencial de biosíntesis proteica en B. abortus bfr. Rol de la bacterioferritina y de los sideróforos en la vida intracelular de B. abortus.
DISCUSIÓN K:=K;
BIBLIOGRAFÍA K;=;
CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS FUTURAS ;8=;<
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Capítulo Uno
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GÉNERO BRUCELLA: CARACTERÍSTICAS
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INVASIÓN Y TRÁFICO INTRACELULAR
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BÚSQUEDA DE FACTORES DE VIRULENCIA
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ANTECEDENTES SOBRE EL METABOLISMO DEL HIERRO Y SU ROL EN LA PATOGENIA DE BRUCELLA
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BIBLIOGRAFÍA
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“No amount of experimentation can ever prove me right, a single experiment can prove me wrong”
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Capítulo Dos
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RESUMEN
6. #
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J INTRODUCCIÓN
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K PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
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Cepas Características genotípicas y fenotípicas Fuente o
Referencia
Brucella abortus
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2.2. Clonado y secuenciación de hemH
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2.3. Construcción del mutante hemH y de la cepa complementada
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2.4. Cultivo de células HeLa y J774 y ensayos de infección
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2.5. Ensayos de infección en ratones
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RESULTADOS
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- B. abortus
Log UFC/g de bazo a las siguientes semanas de infección Cepas empleadas
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BIBLIOGRAFÍA
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Capítulo Tres
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RESUMEN
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INTRODUCCIÓN
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PROCEDIMIENTOS EXPERIMENTALES
3.1. Cepas, medios y condiciones de cultivo
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Cepas Características genotípicas y fenotípicas Fuente o Referencia
Brucella abortus
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3.2. Clonado y secuenciación
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3.3. Construcción de mutantes
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3.4. Expresión, purificación y detección por Western-blot de Irr
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3.5. Detección de protoporfirina IX en sobrenadantes de cultivos de B. abortus
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3.6. Ensayos de unión al hemo
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3.8. Detección de brucebactina en placa y en solución
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3.9. Análisis del 2,3-DHBA por HPLC
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3.10. Ensayo de sensibilidad al peróxido de hidrógeno
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3.11. Ensayo de la actividad catalasa
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3.12. Estimación del contenido del hemo
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3.13. Ensayo de la actividad E-galactosidasa
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RESULTADOS
Identificación, clonación e interrupción de irr en B. abortus
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Acumulación de protoporfirina IX en la cepa 2308IK de B. abortus
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Efecto del hierro sobre la regulación de irr
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Actividad E-galacto sidasa (Unid ades Miller)
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Ensayos de unión al hemo
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Determinación del peso molecular de Irr
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Detección de brucebactina por ensayo en placa
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