Frente a una sobreproducción de especies reactivas, se estudió la respuesta antioxidante total del biofilm (enzimático y no enzimático) que tiene como función
contrarrestar la generación de ERO y ERN (Missall et al., 2004). En la Fig. 4.8 se
muestra la activación del sistema antioxidante total como respuesta a la acción de los extractos en ambas condiciones experimentales (oscuridad e irradiación). El extracto Ben provocó una gran estimulación del sistema antioxidante total en oscuridad e irradiación, respecto de los demás extractos. La activación producida por el extracto
Ben fue 1,8 veces en oscuridad (38,9 ± 1,3 vs. 21,3 ± 1,2) y 3,1 veces en luz
Resultados y Discusión
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En función de los resultados obtenidos, se podría estimar que en oscuridad este incremento es suficiente para contrarrestar las ERN generadas por los extractos Hex, AcOEt y EtOH (Fig. 4.6). Por lo tanto, no se observó un efecto reductor sobre el biofilm (Fig. 4.3). Por otra parte, esta activación de la capacidad antioxidante no fue suficiente para compensar la acción del extracto Ben, que provocó una disminución del
biofilm mediada por las ERN (Peralta et al., 2015).
Figura 4.8Efecto de los extractos de H. pustulata sobre la capacidad antioxidante total
del biofilm de C. tropicalis CRF6, bajo condiciones de oscuridad e irradiación.
Extractos a 0,2 mg/mL. Hex: hexánico, Ben: bencénico, AcOEt: acetato de etilo, EtOH: etanólico. La barra de error representa la desviación estándar obtenida de tres experimentos independientes con n=3 cada uno. *p< 0.05 respecto al biofilm no tratado; #p< 0.05 cuando se compararon oscuridad e irradiación.
Bajo irradiación, los extractos Hex, AcOEt y EtOH generaron una estimulación del sistema antioxidante total que parecería anular completamente el efecto de las ERO y ERN producidas por el extracto Hex que resultó inactivo, o contrarrestarlo parcialmente en el caso de los extractos AcOEt y EtOH que redujeron levemente el biofilm, pero no lo suficiente para observar una fotoactivación de los mismos. Si bien, en presencia del extracto Ben y luz, la activación del sistema antioxidante total fue mayor que para los demás extractos, no fue capaz de contrarrestar las especies reactivas generadas (las cuales alcanzaron niveles más altos respecto a los otros extractos), provocando una reducción significativa del biofilm mediante una fotoestimulación.
Si bien la principal enzima detoxificante de O2¯ (SOD) no se activó, la
Resultados y Discusión
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estarían actuando como una defensa al estrés oxidativo y nitrosativo generado; y por lo tanto no fue posible alcanzar la erradicación del biofilm.
IV.2.4- Generación de oxígeno singlete por los extractos de H. pustulata
En base a los resultados anteriores, que demuestran una fotoestimulación delefecto antibiofilm del extracto Ben, se evaluó la producción de 1O2. Esta ERO sólo se
genera bajo irradiación, ya que necesita una transferencia de energía desde el FS* al
3O2, en un proceso conocido como fotosensibilizante Tipo II. Por tal motivo, se evaluó
si los extractos en solución tenían capacidad de incrementar la generación 1O2 bajo
acción de la luz. Para ello, se usó la sonda SOSG que mide la fluorescencia del
producto de reacción con 1O2 cuando el FS está en solución.
En la Tabla 4.2 se observa el aumento en la producción de 1O2 generado por
los extractos en soluciones de PBS y en presencia de SOSG. Bajo irradiación, se observó un incremento de 4,6 ± 1,2 y 2,55 ± 0,04 veces de esta ERO para los extracto Hex y Ben, respectivamente, en comparación a SOSG.
Tabla 4.2 Incremento en la generación de 1O2 por los extractos de H. pustulata, en condiciones de oscuridad e irradiación respecto de la sonda SOSG.
*no detectado
Se evidenció que los extractos no polares (Hex y Ben) tendrían capacidad para actuar por el mecanismo fotosensibilizante Tipo II. Este resultado indicaría que los metabolitos secundarios presentes en estos extractos podrían actuar como potenciales FS Tipo II.
El estudio de la actividad antifúngica de los extractos obtenidos de H. pustulata
sobre biofilms de C. tropicalis CRF6, mostró que el extracto Ben fue el único bioactivo
bajo las dos condiciones experimentales, exhibiendo un importante efecto reductor sobre el crecimiento del biofilm bajo la acción de la luz. Así, se estableció que el leve
Resultados y Discusión
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efecto reductor de este extracto en oscuridad fue mediado solamente por un estrés nitrosativo (incremento en la generación de ERN); mientras que bajo irradiación, el estrés oxidativo fue el proceso predominante (aumento en la generación de ERO). De esta forma, se evidenció una inactivación fotodinámica del biofilm por acción del extracto Ben, ya que se ha demostrado que las sustancias fotosensibilizantes incrementan los niveles de ERO en presencia de luz, lo cual resulta finalmente en un
estrés oxidativo sobre el microorganismo (Dai et al., 2012; Hamblin, 2016). Se
entiende como estrés a una sobreproducción de especies reactivas, como consecuencia de una estimulación en la producción de las especies o una reducción
en el sistema de defensa antioxidante (Powers et al., 2011). Por tal motivo, la
producción de O2¯ (asociada al mecanismo fotosensibilizante Tipo I) y de NO•
(secuestrante de O2¯ ) se evaluó, como los principales precursores de las ERO y de
las ERN, respectivamente. En consecuencia, se estudió en forma simultánea la capacidad antioxidante total del sistema (enzimático y no-enzimático), como una respuesta a ambos tipos de estrés por medio del ensayo FRAP. Además, la activación
de la enzima SOD se estudió por su acción específica sobre el O2¯ (dismutación de
esta ROS en H2O2). Los resultados obtenidos, permitieron concluir que frente a una sobreproducción de ERO y de ERN (en menor medida) por parte del extracto Ben bajo irradiación, se activa la SOD y el sistema antioxidante total del biofilm. Esto se traduce en una reducción de la biomasa del biofilm, desencadenada por la acción de la luz, pero que no logra la erradicación completa de éste.
En conclusión, se observó una significativa acción antibiofilm del extracto Ben, mediada por un efecto fotodinámico, en donde predominaría la estimulación de la
producción de O2¯ (mecanismo fotosensibilizante Tipo I).
A pesar que no se pudo demostrar que el mecanismo fotosensibilizante Tipo II
(generación de 1O2) estaría actuando sobre el biofilm, se evidenció que el extracto Ben
y por lo tanto, sus constituyentes químicos, incrementan esta ERO en solución de PBS bajo irradiación. Por lo cual, los metabolitos secundarios presentes en este extracto cobran especial interés como potenciales FS.
Con el fin de establecer los metabolitos secundarios responsables del efecto observado por los extractos ensayados, a continuación se procedió a realizar el análisis químico de los mismos.
Resultados y Discusión
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IV.3- ANÁLISIS QUÍMICO DE LOS EXTRACTOS DE H. pustulata ENSAYADOS
SOBRE BIOFILMS
Estudios químicos previos demostraron que derivados antraquinónicos y flavonoideos caracterizan esta especie vegetal, siendo las AQs aglicones los
metabolitos secundarios mayoritarios (Fig. 1.6 de Introducción) (Núñez Montoya et al.,
2003; 2006). En consecuencia, para determinar la composición química de los
extractos, se desarrolló una metodología mediante HPLC-UV-Vis y una metodología HPLC-DAD-ESI-MS-QTOF.