Activación de los soportes e inmovilización

Los soportes comerciales empleados pasaron por procesos de activación en que se les añadieron grupos reactivos (Figuras 5.2 y 5.3). Durante los procesos de inmovilización se realizó un seguimiento de la actividad enzimática en el sobrenadante y en el total de la suspensión. La diferencia entre ambas proporcionó el valor de la actividad MnP retenida en el soporte. Así, se comprobó la capacidad de retención del soporte y la estabilidad del derivado durante el proceso, pues en ocasiones las condiciones de inmovilización son severas y alteran la conformación de la proteína. En el caso de los derivados basados en una interacción iónica entre los grupos del soporte y de la enzima, tras la inmovilización se procedió a realizar una desorción para comprobar la fortaleza de la unión. Para ello, se aumentó progresivamente la fuerza iónica del medio y se determinó la actividad enzimática en el sobrenadante y la suspensión, hasta que toda la actividad del derivado se obtuvo en el sobrenadante.

i) Sepabeads-IDA

Para la activación del soporte se tomaron 10 g de Sepabeads-EC3, se lavaron y se unieron a 18 mL de una disolución de borato sódico 100 mM y ácido iminodiacético (IDA) 2 M a pH 11. Tras 24 h de agitación, los grupos epóxido que no reaccionaron se bloquearon con mercaptoetanol al 2% (w/v), y tras 14-16 h se lavó el soporte.

La inmovilización se realizó con una relación soporte:derivado de 1:10, es decir, 1 g de soporte se llevó a 10 mL de derivado, con malonato 5 mM pH 4 y MnSO4 0,5 mM. Para ello se tomó 1 g de Sepabeads-IDA, se añadió el volumen

MnP con el fin de que la actividad final en el derivado fuese de 200 U/L. Se tomaron muestras de sobrenadante y suspensión hasta que la actividad MnP en el sobrenadante fue nula.

ii) Agarosa-dextrano-aspártico

Se disolvieron 1,67 g de dextrano en 50 mL de agua, y se oxidó el 80% de los grupos –OH con 3,49 g de periodato, para su posterior unión a los grupos aspártico. Tras 2 h de agitación a temperatura ambiente, en campana, el dextrano- aldehido obtenido se dializó frente a agua, para eliminar el periodato en exceso y el formaldehido que se forma al romper los azúcares durante la oxidación. La diálisis se realizó en relación 1:100 cambiando el medio unas 5-6 veces, durante 2-3 d. Tras esto se unió, en relación de volúmenes iguales, el dextrano-aldehido con aspártico 3 M pH 7,5 que contenía 200 mM de tri-metil-amino-borano, que actúa de estabilizante de la base de Schiff. La solución resultante se agitó durante toda la noche con agitación magnética, en un recipiente cerrado. A esta disolución se añadió un 10% (v/v) de tampón carbonato 500 mM pH 10,5 con borohidruro sódico 100 mg/mL, que reduce los grupos aldehido que no reaccionaron con el aspártico. Se agitó magnéticamente en campana, en recipiente cerrado, durante 30 min. Tras este tiempo, se disminuyó el pH hasta 6 con HCl. Se dializó frente a agua durante 2-3 d.

La unión de los dextranos al soporte de agarosa se realizó tras la oxidación del 20% restante de los grupos alcoholes del dextrano. Para ello se añadieron 0,872 g de periodato a la disolución anterior, se agitó magnéticamente durante 2 h a temperatura ambiente y se realizó una diálisis para eliminar el formaldehido que se forma al oxidar los azúcares del dextrano, ya que es muy reactivo. La unión con el soporte se realizó uniendo, en relación 1:10 (1 mL de agarosa por cada 10 mL de disolución final), agarosa-amino de baja activación (10-15 µmoles/mL) con dextrano-aspártico con 50 mM de fosfato pH 7,5. A esta disolución se añadió de forma sólida tri-metil-amino-borano hasta alcanzar 150 mM. Se agitó suavemente durante 24 h a temperatura ambiente. La reducción de los grupos oxidados del dextrano que no se unieron al soporte se realizó añadiendo carbonato 500 mM pH 10,5 con 10 mg/mL de borohidruro al 10% (v/v), y se agitó durante 30 min. Posteriormente el soporte se lavó abundantemente con agua y se secó a vacío.

La inmovilización se realizó en relación 1:10 con malonato 5 mM pH 4 y MnSO4 0,5 mM. Se comprobó la desorción añadiendo fosfato en adiciones de 25

mM, hasta que toda la actividad enzimática se midió en el sobrenadante.

iii) Sepabeads-PEI

Se pesaron y lavaron 50 g de Sepabeads-EC3 y se añadieron a una disolución de 200 g/L de polietilenimina (PEI) de peso molecular 25.000, a pH 10 para favorecer la ruptura de los grupos epóxidos del soporte y la formación de más enlaces entre los OH del soporte y los grupos NH2 de la PEI. Se agitó la

disolución resultante a 100 rpm durante 48 h a temperatura ambiente. El soporte se lavó abundantemente con agua y se secó. Los grupos epóxidos que no reaccionaron con la disolución de PEI se bloquearon con 250 mL de etilendiamina 2 M a pH 10. Se agitó durante 16-18 h, se lavó el soporte con agua y se secó a vacío.

La inmovilización se realizó en relación soporte:derivado de 1:10 con fosfato 5 mM pH 7 y MnSO4 0,5 mM. Se comprobó la desorción del derivado

nuevo y envejecido mediante la adición de fosfato de 25 en 25 mM.

iv) Sepabeads-EDA

Se unieron 10 g de Sepabeads-EC3 a 18 mL de una disolución de etilendiamina (EDA) 500 mM pH 11. Se agitó durante 24 h y se bloquearon los grupos epóxido que no reaccionaron con mercaptoetanol al 2% (w/v). Tras 14-16 h, se lavó el soporte con abundante agua y se secó a vacío. La inmovilización sobre el soporte totalmente activado se realizó en relación 1:10, con fosfato 5 mM pH 7 y MnSO4 0,5 mM.

v) Agarosa-glutaraldehido

Para obtener un soporte agarosa-glutaraldehido totalmente activado, se deben generar grupos dioles en la superficie del soporte. Para ello se resuspendieron 150 g de agarosa en 30 mL de agua y se unieron a 50 mL de una disolución de NaOH 1,7 N conteniendo 28,5 mg/mL de borohidruro sódico. Se adicionó lentamente glicidol (2,3-epoxipropanol) 2 M para efectuar la eterificación de la agarosa. Se mantuvo una agitación suave durante 18 h a temperatura ambiente, el gel se lavó con abundante agua destilada y se secó a vacío. Se obtuvo así el gel gliceril, con unos 75 µmoles de grupos reactivos

(dioles) por mL de gel. Este gel gliceril se oxidó con 75 µmoles de periodato por mL de gel durante 1-2 h, de manera que se obtuvieron grupos aldehido, constituyendo el gel glioxil (Guisán et al., 1997). Tras este tiempo se lavó el soporte con agua y se añadieron 858 mL de EDA 2 M pH 10, agitándose durante 2 h, con lo que se obtuvieron grupos amino primarios y secundarios. Los posibles grupos nitro que se hubieron podido formar durante el ajuste de pH de la EDA se redujeron con borohidruro de sodio (10 mg por mL de disolución) y se agitó durante otras 2 h. El gel se lavó con 1 L de acetato de sodio 0,1 M pH 4 (con el fin de detener la reducción), 1 L de borato de sodio 0,1 M pH 10 (para ajustar el pH) y abundante agua destilada. Se obtuvo así el gel agarosa-amino. Para la obtención del gel agarosa-glutaraldehido, 20 g de gel amino se unieron a 22,4 mL de fosfato 0,2 M pH 7 y 33,6 mL de glutaraldehido al 25%. Se ajustó el pH a 7 y se agitó durante 12-14 h. Tras este tiempo se lavó el soporte abundantemente con agua y se secó. Los soportes glutaraldehido se utilizaron el mismo día que se obtuvieron.

La inmovilización se realizó en relación 1:3 con fosfato 5 mM pH 7 y MnSO4 0,5 mM. La reducción de los grupos que no reaccionaron con la enzima se

llevó a cabo tras 24 h llevando 2 g de soporte, en un baño de hielo, a 200 mL con bicarbonato de sodio 200 mM pH 8,1, y añadiendo 0,1 mg de borohidruro de sodio por mL de suspensión. Al cabo de 20 min, se añadieron otros 20 mg. Tras 1 hora se lavó con acetato a pH 5 y luego con agua.

vi) Sepabeads-EP

La inmovilización de MnP en el soporte comercial Sepabeads-EP se realizó en relación soporte:derivado 1:3, en presencia de fosfato 1 M pH 7 y MnSO4 0,5

mM. Tras la inmovilización, se lavó y secó el derivado y se bloquearon los grupos epóxidos que no reaccionaron con la enzima mediante la adición de 5,75 mL de glicina 3 M pH 7 por g de soporte. El derivado se mantuvo en agitación 12-14 h, se lavó con abundante agua y se secó (Wheatley & Schmidt Jr., 1999; Mateo et al., 2000a).

vii) Sepabeads-EP (long arm)

La inmovilización de MnP sobre el soporte Sepabeads-EP (long arm) se realizó en relación 1:10 con fosfato 5 mM pH 7 y MnSO4 0,5 mM. Tras 1 d de

inmovilización, los derivados se bloquearon con glicina 3 M pH 7, para evitar la reactividad de los epóxidos que no hubieron reaccionado con la enzima.

viii) Agarosa-amino

En el caso de una enzima como la MnP, altamente glicosilada, se realizó previamente la oxidación de los grupos OH de los azúcares que la rodean. Para ello se añadieron 10 µmoles/mL de periodato sódico al crudo enzimático, y se agitó durante 1 h, midiendo la actividad de la enzima para evaluar si el oxidante afecta a su estabilidad. Al cabo de este tiempo la enzima se dializó para eliminar el periodato sobrante, y se inmovilizó sobre agarosa-amino, altamente activada, obtenida tal como se describió anteriormente, como etapa en la obtención de los geles agarosa-glutaraldehido (Guisán et al., 1997).

La inmovilización se realizó en relación 1:3 con alta fuerza iónica, es decir, fosfato 1 M pH 7 y MnSO4 0,5 mM. Tras 24 h de inmovilización, los grupos

carboxilo de la enzima que no reaccionaron se redujeron con borohidruro, siguiendo un proceso similar al empleado con los soportes de agarosa- glutaraldehido.

ix) Sepabeads-IDA (20%)

Se tomaron 10 g de Sepabeads-EC3, se lavaron y se unieron a 18 mL de una disolución de borato sódico 100 mM y ácido iminodiacético 2 M a pH 8. El derivado se agitó durante 1 h, se lavó con agua y se secó a vacío. De este modo se activa un 10-20% de los grupos epóxido del soporte. La inmovilización se realizó en relación 1:3 a baja fuerza iónica, con malonato 5 mM pH 4 y MnSO4 0,5 mM.

Tras la misma, el derivado se bloqueó con glicina 3 M pH 7, tal y como se describe en los soportes Sepabeads-EP y Sepabeads-EP (long arm) (Mateo et al., 2000c).

x) Sepabeads-IDA-Cu (20%)

A 2 g de Sepabeads-IDA se adicionaron 0,496 g de sulfato de cobre y 11,42 mL de agua. El derivado resultante se agitó durante 2 h a temperatura ambiente y se lavó con agua. La inmovilización en el soporte activado al 10-20% se realizó en relación 1:3 con fosfato 5 mM pH 7 y MnSO4 0,5 mM. Tras la inmovilización

xi) Sepabeads-EDA (20%)

Para obtener un soporte con un 10-20% de los grupos activados, se unieron 10 g de Sepabeads-EC3 con 18 mL de una disolución de EDA 500 mM pH 7. Se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. Tras esto, el derivado se lavó con abundante agua y se secó a vacío. La inmovilización se realizó en relación 1:3 a baja fuerza iónica y pH 7, es decir, con fosfato 5 mM pH 7 y MnSO4 0,5 mM.

Tras la misma, el derivado se bloqueó con glicina 3 M pH 7 (Mateo et al., 2000c).

xii) Sepabeads-boronato (20%)

Para activar el 10-20% de los grupos epóxido del soporte, se preparó una disolución de aminofenilborónico al 2% (w/v) disuelto en un 20% de dioxano o acetonitrilo, y se ajustó el pH a 8. Tras esto se unieron 10 g de Sepabeads-EC3 con 33 mL de dicha disolución y se agitó durante 1 h a temperatura ambiente. El derivado se lavó abundantemente con agua. La inmovilización se realizó en relación 1:3 con fosfato 5 mM pH 7 y MnSO4 0,5 mM. Tras la misma, el derivado

se bloqueó con glicina 3 M pH 7 (Mateo et al., 2000c).