ANEXO I: AMINOÁCIDOS
1. INTRODUCCIÓN 21
1.1. ANTECEDENTES 21
1.1.4. Activación de PAR1 por trombina: Estudios estructurales 32
La trombina posee alta capacidad para adoptar diferentes conformaciones o formas alostéricas. En condiciones fisiológicas es capaz de adoptar tres formas: Una forma inactiva E*, incapaz de unir Na+ o sustratos en su sitio activo, que está en equilibrio con una forma activa E, capaz de unir Na+, pero no la mayoría de sus sustratos, denominada forma lenta o de baja actividad. Esta forma lenta está, a su vez, en equilibrio con la forma ligada a Na+, E:Na+ (Figura 4a), denominada rápida, altamente activa y necesaria para la
unión de la mayoría de sus sustratos fisiológicos, entre los que se encuentra PAR1121.
En la estructura de trombina se han identificado cuatro sitios esenciales: a) El sitio activo, localizado en un canal interno, donde se sitúan los residuos S195, H57 y D102 (Figura 4a), cuya entrada está controlada por la unión de Na+, a través del D189; b) El sitio de unión de Na+; c) El exositio I, que contiene diversos aminoácidos básicos, que facilitan la orientación óptima de la mayoría de sus sustratos, como el fibrinógeno, la trombomodulina o PAR1, y de sus inhibidores naturales como la hirudina; d) El exositio II, opuesto al exositio I, constituido por una hélice α C-terminal, en el que se unen los ligandos polianiónicos, como la heparina, los glucosaminoglicanos, el receptor de plaquetas GpIb, o los anticuerpos121. En general, la unión de sustratos al exositio I
produce un cambio conformacional a nivel del canal del centro activo, situado a ≈30 Ǻ, que se refleja en un cambio en la orientación de las cadenas de W215 y R221 para permitir la entrada del sustrato en el canal, como se muestra en la Figura 4b para la interacción trombina/PAR1.
Figura 4.- a) Estructura de rayos X de la forma E:Na+de trombina121: Se indican los residuos del centro
activo (S195, H57 y D102), los exositios I y II, el sitio de unión a Na+ y el bucle hidrófobo 60 . b) Estructura de
rayos X de la trombina unida a la secuencia extracelular S42-N62 de PAR1122: La estructura de
trombina unida al fragmento de PAR1 se muestra en color verde, resaltando en azul la lamina β, en la que se localiza W215, y el bucle de R221a, superpuesta sobre la estructura de la trombina en la forma libre E (en color verde más claro, con W215 y R221a en rojo). El fragmento de PAR1 unido al exositio I se indica en amarillo.
INTRODUCCIÓN
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Al igual que en otros GPCRs, la naturaleza transmembrana de PAR1 ha dificultado los estudios estructurales de este receptor. A pesar de ello, en los últimos 10 años diversos estudios estructurales han aportado información significativa sobre la estructura del receptor y sus interacciones con trombina17. Esta información se ha obtenido a través
de estudios de mutagénesis dirigida, tanto sobre PAR1 como sobre trombina18,19,123-130,
de estudios de rayos X sobre trombina humana cristalizada con diversos fragmentos del exodominio N-terminal de PAR1122,131,132, conteniendo todos ellos la secuencia similar a hirudina, y del estudio mediante RMN de la estructura de la secuencia N-terminal de PAR1 (Ala26-Hse103), en comparación con la de la secuencia resultante de proteólisis por trombina (Ser42-Hse103)20. En la Tabla 1 se resume la información resultante de estos estudios, agrupada según los distintos dominios estructurales identificados en PAR1.
Tabla 1.- Aminoácidos relevantes para la interacción trombina/PAR1
Mutagénesis Rayos X RMN
Dominio de PAR1 PAR1 Trombina PAR1 Trombina PAR1
Reconocimiento por proteasas (L38DPR41) L38 L99, I174, W215 L38 L99, I174, W215 D39 H57 P40 S195, H57 R41 Ligando activador (S42FLLRN47) F43 S195, H57 L45 S195, H57 F43, L44, R46 R46 E39 Secuencia similar a hirudina (D50KYEPF55) D50 R73, K149 D50 R73, K149 Y52 Y52 R73, F34 D50, K51
E53 R67 E53 T74,Y76
F55 I82, Y76 F55 R67, F34, I82
LBS (L84PAFIS89) F87, I88, S89 P85, A86, S89, I88
ECL-2 (Q242---G265) D256
E260
ECL-3 (A335---E350) E347
INTRODUCCIÓN
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En el dominio de reconocimiento de PAR1 por proteasas (L38DPR41) los estudios de mutagénesis han mostrado que el residuo de R41 es crítico para la activación del receptor18. Otros estudios indican que L38 y P40 son también importantes para la
proteólisis eficiente por trombina125. Un modelo 3D de PAR1 unido a trombina muestra
que L38 ocupa el sitio de unión de grupos aromáticos de trombina, formado por L99, I174 y W215124. Uno de los estudios de rayos X confirma esta hipótesis y también indica que la interacción dominante de PAR1 en el sitio activo de trombina es el puente iónico entre el D39 de PAR1 y la H57 de trombina131.
En lo que respecta al ligando activador (S42FLLRN47), los estudios de mutagénesis sugieren la existencia de interacción entre la R46 de PAR1 y el E39 de trombina, a través de un par iónico, y de los residuos de PAR1 F43, L45 y P40, éste ultimo en el sitio de proteólisis, con el W60d, situado en el bucle 60 de trombina, y con los residuos del centro activo S195 e H57124. Además, el estudio de RMN indica una fuerte interacción intramolecular de la F43 con la S89 (se observan 8 NOEs) y de la L44 con la I8820. Tanto la S89 como la I88 se localizan en el denominado sitio de unión del ligando activador (L84PAFIS89). En los estudios de rayos X la secuencia del ligando activador no se resuelve bien, hecho que se ha relacionado con su alta movilidad1.
Estudios de mutagénesis sobre el dominio que contiene la secuencia similar a hirudina (D50KYEPF55), así como su supresión, indican que la presencia de esta
secuencia es esencial para la unión de trombina con alta afinidad126. Además, la unión
de dicho dominio, como ya se ha comentado, induce efectos alostéricos en la trombina, que conllevan un aumento considerable en la eficiencia de la proteólisis122-124,126. Del conjunto de resultados de los estudios de mutagénesis, rayos X y RMN se deduce que los residuos D50, Y52, E53 y F55 establecen interacciones específicas importantes para la unión trombina/PAR1. De ellos, Y52, que interacciona con R73 y F34 de trombina, parece ser especialmente crucial20,123,131. Los estudios de mutagénesis124,127 y uno de los estudios de rayos X131 también destacan la importancia del E53, que establecería un par
iónico con la R67 de la trombina. Sin embargo, según los estudios de rayos X más recientes122,132, E53 se orientaría hacia fuera de la superficie de la trombina (Figura 5), interaccionando con T74 y con Y76. Estos estudios muestran también la importancia de la interacción de D50 de PAR1 con R73 y K 149 de trombina, así como la interacción de la F55 de PAR1 con el bolsillo hidrófobo de trombina definido por F34, I82 y L65, y con el residuo básico de R67.
INTRODUCCIÓN
35 Figura 5.- Modelo de la estructura de la unión de la secuencia de PAR-1 D50KYEPFW56 (símbolos de los aminoácidos en negro) al exositio I de trombina122 (residuos implicados en azul)
Mediante la utilización de un anticuerpo policlonal, anti-PAR1(1-160), que inhibe la activación de PAR1 en varios tipos de células que expresan este receptor, y experimentos ELISA se identificó en este receptor la secuencia (L84PAFIS89),
denominada LBS (Sitio de unión del ligando), a la que se une intramolecularmente el ligando activador129. Posteriormente, la importancia de esta secuencia fue confirmada en el estudio de RMN ya comentado20. Además de las interacciones ya indicadas, este estudio identificó interacciones del enlace peptídico D50-K51 con P85 y A86, resultado que sugiere que el ligando activador se extiende hacia la secuencia similar a hirudina. El estudio también sugiere la presencia de un giro en la secuencia activadora a nivel de la R46, de forma que su grupo guanidino se proyectaría hacia fuera del LBS. Por otra parte, uno de los estudios de mutagénesis mostró la importancia de I88 y S89 en el LBS, de E347 en el 3º bucle extracelular (ECL-3) y de E256 en el 2º bucle extracelular (ECL-2) para las respuestas funcionales a la activación por agonistas (trombina o PAR1-APs)19. Este estudio muestra también que algunas mutaciones capaces de eliminar la respuesta a PAR1-APs sintéticos tienen poco efecto sobre la activación por trombina. Este resultado sugiere que el sitio de unión de los PAR1-APs no coincide con el sitio de unión
INTRODUCCIÓN
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intramolecular del ligando activador. En este sentido, hasta el momento, no se ha determinado el sitio de unión de ningún ligando sintético, tanto agonista como antagonista. Sin embargo, se ha observado que agonistas diferentes ejercen diferentes efectos sobre un mismo tipo de célula13,20,133,134.