Actividad antioxidante

Un antioxidante es por definición una molécula capaz de retardar o evitar la oxidación de otra, generalmente a través de su propia oxidación. Hay multitud de compuestos que actúan como moléculas antioxidantes como por ejemplo algunas enzimas, como la peróxido dismutasa, moléculas biológicas como la ferritina, la albúmina o los estrógenos, sustancias procedentes de fuentes naturales, como vitaminas (C, E), compuestos fenólicos o carotenoides.

Los antioxidantes pueden neutralizar los radicales (O2•-, 1O2, HO•, NO•, ONOO-,

HOCl, RO(O) •, LO(O)) mediante dos mecanismos principalmente: la transferencia de átomos de hidrógeno (ecuación 1) y la transferencia de electrones (ecuaciones 2, 3, 4, 5): X• + AH→ XH + A• (1) X• + AH → X- + AH•+ (2) AH•+ (H2O) → A• + H3O+ (3) X- + H3O+→ XH + H2O (4) M(III) + AH → AH+ + M(II) (5)

La forma más extendida de evaluar la actividad antioxidante de una sustancia es mediante métodos in vitro espectrofotométricos. Los principales métodos son ORAC, FRAP, TEAC y DPPH. El método ORAC se considera relevante para los sistemas biológicos, ya que mide el radical peroxilo, que es el más abundante de los radicales libres [264]. El ensayo FRAP mide la capacidad de los antioxidantes para reducir el

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complejo férrico tripiridil triazina. La principal limitación de este método es que la capacidad de reducción no refleja necesariamente la actividad antioxidante [265], dado que el método no proporciona un sustrato oxidable. Por su facilidad de operación, los ensayos DPPH y TEAC son los más extendidos. El ensayo de DPPH se basa en la detección del radical cromógeno DPPH. El inconveniente principal de este ensayo es que este radical, que es un radical de nitrógeno estable, no tiene ninguna similitud con los radicales altamente reactivos y transitorios formados en la peroxidación de lípidos. Por otro lado, el método TEAC se basa en la capacidad de los antioxidantes para captar el radical 2,20-azonobis (3-etilbenzotiazolina-6-sulfonato) más conocido como ABTS+; sin embargo este radical no se encuentra en los sistemas biológicos, por lo que el ensayo TEAC ha sido criticado por usar un radical no fisiológico.

El ensayo TEAC fue expuesto por primera vez por Miller y col. (1993) [266]. En este ensayo, el ABTS se oxida por los radicales piróxilo u otros oxidantes a su catión radical, ABTS•+, el cual se colorea intensamente, y la actividad antioxidante es medida como la capacidad de los compuestos de ensayo para disminuir el color al reaccionar directamente con el radical ABTS•+. Los máximos de absorción del ABTS•+ son 415, 645, 734 y 815 nm, aunque son las longitudes de onda de 415 y 734 nm las adoptadas principalmente para la observación espectrofotométrica de la reacción entre los antioxidantes y el radical ABTS•+. En términos de cuantificación, la medida de la disminución de absorbancia del ABTS•+ en presencia de la muestra en un tiempo fijo (4- 6 min), se lleva a cabo mediante la comparación con el estándar de Trolox (6-hidroxi- 2,5,7,8 tetrametilcroman-2-carboxílico) proporcionando los resultados de la capacidad antioxidante como equivalentes de Trolox (TE).

Las principales ventajas de este método son que el radical ABTS•+ reacciona rápidamente con los antioxidantes, generalmente a los 30 minutos. Además, se puede utilizar un amplio rango de pH y lo que permite estudiar los efectos del pH sobre los mecanismos antioxidantes. Otra ventaja es que el ABTS•+ es soluble tanto en disolventes acuosos como orgánicos y no se ve afectado por la fuerza iónica, por lo que se puede utilizar en múltiples medios para determinar las capacidades antioxidantes tanto de sustancias hidrófilas como lipófilas de extractos y de fluidos corporales [267].

41 1.4.2 Actividad antiinflamatoria

La inflamación es el conjunto de respuestas proporcionada por los tejidos vivos frente a agresiones de diferente naturaleza, que determina una serie de cambios en los sistemas homeostáticos, como la sangre o el tejido conectivo para localizar, aislar, y eliminar el agente agresor y, consecuentemente, reparar el daño ejercido por él. Existen multitud de agentes que pueden causar inflamación, agentes biológicos como bacterias, virus, hongos y parásitos, agentes físicos o químicos como por ejemplo el calor y las toxinas, los traumatismos o determinadas alteraciones inmunitarias.

El proceso inflamatorio tiene un componente local y otro sistémico. En el primero participan los sistemas de complemento, de coagulación y de las quininas, así como metabolitos del ácido araquidónico y varias citoquinas, por lo que se genera vasodilatación local, trasudación de líquidos, formación de edema, aumento de la temperatura local y desplazamiento de células de la sangre hacia el tejido afectado. La respuesta sistémica, en cambio, se caracteriza por fiebre, leucocitosis e incremento de proteínas de fase aguda de inflamación.

Los macrófagos, debido a su capacidad fagocítica, son las células que inician el proceso inflamatorio sintetizando citoquinas. Las citoquinas actúan como mediadores principales en el proceso inflamatorio y la unión de la citoquina a su receptor se traduce en una cascada de señales intracelulares que termina en el control de uno o varios genes. La principal citoquina implicada en el proceso inflamatorio es el factor de necrosis tumoral alfa (TNF-α), una citoquina proinflamatoria que es sintetizada inicialmente por células de la línea monocítica. La TNF-α activa el endotelio vascular, incrementando su permeabilidad y favoreciendo la entrada de inmunoglobulina (Ig) G, un tipo de anticuerpo humoral cuya principal función es facilitar la fagocitosis por parte de los macrófagos. Otras citoquinas que regulan la inflamación y actúan como mediadores químicos son las interleuquinas IL-1β e IL-6, las que generalmente son sintetizadas por los macrófagos en el lugar de la inflamación. La IL-1β está implicada en gran variedad de actividades celulares, incluyendo la proliferación celular, la diferenciación, y la apoptosis; además es la responsable del aumento del flujo sanguíneo local durante el proceso inflamatorio, aumenta la expresión de moléculas de adhesión y tiene acción pirógena. La IL-6 es una glucoproteína segregada por los macrófagos, células T, células

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endoteliales y fibroblastos. Su liberación está inducida por la IL-1 y se incrementa en respuesta a la TNF-α. Es un pirógeno endógeno que estimula en la hipófisis la producción de la hormona ACTH, además es capaz de atravesar la barrera sangre- cerebro e iniciar la síntesis de la prostaglandina E2 (PGE-2) en el hipotálamo, cambiando de este modo la temperatura de consigna del cuerpo. En el tejido muscular y graso, IL-6 estimula la movilización de la energía que conduce a un aumento de la temperatura corporal. También interviene en la producción de inmunoglobulinas, en la diferenciación de linfocitos B, activa a los linfocitos T citotóxicos, células plasmáticas, modula la hematopoyesis y es la responsable, junto con la IL-1, de la síntesis de proteínas de fase aguda en el hígado, en especial fibrinógeno. Al unirse IL-1β al receptor de membrana IL tipo I, se desencadena una señal intracelular vía MAPK, activándose NF-κB y AP-1, un factor de transcripción, lo que provoca un incremento en la síntesis de genes proinflamatorios, incluida la amplificación autocrina de IL-1β. La citoquina IL-10, en cambio, actúa como interleuquina antiinflamatoria. Inhibe la secreción de citoquinas, probablemente disminuyendo la expresión de NF-κβ y en presencia de IL-10 en los macrófagos se inhibe la expresión de la oxido nítrico sintasa inducible (iNOS), así como la adhesión de los monocitos al endotelio.

La prostaglandina E2 (PGE-2) es un mediador que aumenta su síntesis durante el proceso inflamatorio. Causa vasodilatación, aumenta la permeabilidad vascular permitiendo el paso de los leucocitos, actúa como antiagregante plaquetario y estimula las terminaciones nerviosas del dolor, facilitando la progresión de la inflamación. Por otro lado la ciclooxigenasa 2 o prostaglandina endoperóxido sintasa (COX-2) es la enzima encargada de la síntesis de PGE-2 a partir de ácido araquidónico. Existen dos isoformas de COX, COX-1 y COX-2. COX-1 además de intervenir en la producción de prostaglandinas y sintetizar PEG-1, tiene como función regular la proliferación de las células normales. COX-2 únicamente sintetiza PEG-2 en respuesta a señales proinflamatorias como infecciones, estrés, citoquinas o lipopolisacáridos y su expresión es estimulada por diversos mediadores inflamatorios como interferón γ, TNF-α, IL-1β o factores de crecimiento, en diversas células tales como monocitos, macrófagos, células endoteliales, sinoviocitos, condrocitos y osteoblastos.

El factor NF-κB, es un factor de transcripción que regula la expresión de genes vinculados a la proliferación celular, respuesta inflamatoria y la adhesión celular. NF-

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κB regula la expresión génica de iNOS, COX-2 y citoquinas como TNF-α, IL-1β o IL- 6.

Algunas de las principales patologías causadas por un proceso inflamatorio crónico son la aterosclerosis, el cáncer, la artritis reumatoide, osteoporosis y enfermedades neurodegenerativas como el Alzheimer [268-271].

Una de las principales patologías que promueven la aparición de cardiopatías y enfermedades cerebrovasculares es la aterosclerosis. Este es un proceso inflamatorio- fibro-proliferativo que ocurre en las arterias en las que se produce una formación progresiva de placas o ateromas, que sobresalen hacia el interior de las arterias, dando lugar a la reducción del flujo sanguíneo y con ello a la aparición de estados isquémicos. El desarrollo de estas placas en el interior de las arterias puede derivar en una trombosis oclusiva o una estenosis gradual, ocasionando en el primer caso la infartación del órgano que es alimentado por esa arteria, como es el ataque al corazón o la apoplejía cuando se ve afectada la arteria cerebral, y en el caso de la estenosis se produce un daño progresivo del órgano afectado. Las principales causas de la aterosclerosis son la hipertensión, la hipocolesterolemia, la obesidad y la diabetes.

Este proceso inflamatorio está directamente relacionado con las lipoproteínas LDL y las especies reactivas de oxigeno (ROS). En un primer estado las lipoproteínas LDL pueden ser oxidadas por ROS dando lugar a la forma oxidada ox-LDL. Esta ox-LDL contribuye a la migración de los monocitos y los linfocitos a la zona media del endotelio y la conversión de los monocitos en macrófagos, dándose también la agregación plaquetaria. Durante este proceso se produce la activación de factores de transcripción como NF-κB que promueven la expresión de mediadores proinflamatorios como el factor de necrosis tumoral (TNF-α) la interleuquina 6 (IL-6), además VCAM-1 y ICAM-1, dándose la progresión de la inflamación. Cuando la lesión esta en un estado más avanzado se originan placas fibrosas que constan de una capa de tejido conjuntivo con células vasculares del musculo liso (VSMC), situadas sobre acumulación de lípidos, macrófagos y linfocitos. En determinado momento las células T activadas pueden estimular la producción de metaloproteinasa por los macrófagos en las lesiones, promoviendo la inestabilidad de la placa formada. Cuando esta lesión inicial causante de la placa de ateroma se desestabiliza o degrada, se facilita la formación de un trombo,

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que puede derivar en trombosis y ésta en síndromes coronarios e infartos de miocardio y cerebrovasculares. [272, 273].