IV. HIPÓTESIS
7.6 Actividad antioxidante in vitro
7.6.1 Prueba de autoxidación de pyrogallol
La tabla 7.1 se muestran los resultados del comportamiento de la variación de la absorbancia del blanco, el control y las diferentes concentraciones de ficocianina y luteína que fueron utilizadas para medir la capacidad de captación del radical anión superóxido (0 2*).
Los resultados mostraron, que en el sistema modelo de 10 mM de pyrogallol, cuando se agregó 25 y 50 pg / mL de luteína respectivamente, se presentó una disminución en la variación de la absorbancia, lo cual es indicativo de la capacidad antioxidante, sin embargo, 100 pg / mL de luteína mostraron mayor capacidad antioxidante, no obstante, esta no fue significativamente mayor que cuando se utilizaron 25 y 50 pg / mL de acuerdo al análisis estadístico presentado en la tabla 7.2. Cuando se adicionaron 25, 50 y 100 pg / mL de ficocianina, estas presentaron capacidad antioxidante, aunque menor que en las muestras de luteína a 25 y 50 pg / mL, lo que indica que, al menos en el sistema de 10 mM de pyrogallol, 100 pg / mL presentó un índice mayor de inhibición en la formación de radicales superóxido. La mezcla antioxidante luteína / ficocianina en concentración de 25 pg / mL presentó mayor capacidad antioxidante, en comparación con la muestra de luteína y ficocianina a 25 pg/mL actuando por separado, lo que indicó que la mezcla antioxidante generó un efecto sinèrgico en su acción de bloquear la formación de radicales superóxido. En general la mezcla luteína / ficocianina en 100 pg / mL presentó mayor capacidad antioxidante, aunque levemente mayor comparado con las muestras de luteína y ficocianina por separado.
Cuadro 7.1 Diferencias en la absorbancia para las concentraciones de luteína, ficocianina y mezcla ensayadas para medir captación de ( V por autoxidación de pyrogallol con respecto a blanco. DO ± S: Valor medio de tres repeticiones y desviación estándar
Mezcla Variación en la Absorbancia.
antioxidante Concentración de pyrogallol.
I___________
1 10 mM 15 mM 30 mM Blanco 0.005 ±0.002 0.009 ± 0.003 0.013 ±0.004 Luteína 25 pg/mL 0.003 ± 0.002 0.005 ± 0.002 0.004 ± 0.002 Luteína 50 pg/mL 0.003 ±0.001 0.003 ±0.001 0.002 ± 0.001 Luteína 100 pg/mL 0.001 ±0.001 0.001 ±0.001 0.001 ± 0,001 Ficocianina 25 pg/mL 0.004 ± 0.002 0.006 ± 0.002 0.006 ± 0.002 Ficocianina 50 pg/mL 0.004 ± 0.002 0.004 ±0.001 0.003 ± 0.002 Ficocianina 100 pg/mL 0.002 ±0.001 0.002 ± 0.001 0.002 ±0.001 Mezcla 25 pg/mL 0.003 ±0.001 0.005 ± 0.003 0.005 ± 0.002 Mezcla 50 pg/mL 0.002 ± 0.002 0.003 ± 0.002 0.002 ! 0.001 Mezcla100 pg/mL 0.001 ±0.002 0.001 ±0.001 0.001 ± 0.001Cuando al sistema modelo con 15 mM de pyrogallol se le adicionó luteína a 25 pg / mL presentó capacidad antioxidante en un orden de magnitud mayor comparado con el sistema en 10 mM de pyrogallol. Cuando se adicionó 50 y 100 pg / mL de luteína presentaron actividad antioxidante, este comportamiento es parecido con respecto a las pruebas en el sistema de 10 mM. Las muestras de ficocianina a 25 pg / mL presentó actividad antioxidante, aunque no fue significativa. Este comportamiento fue parecido comparado con el sistema a 10 mM. Para las concentraciones de 50 y 100 pg / mL de ficocianina fue donde la actividad antioxidante fue mas remarcada. En la mezcla luteína / ficocianina presentó mayor actividad antioxidante en concentración de 50 y 100 pg / mL. El comportamiento en las tres concentraciones de mezcla antioxidante fue similar con respecto a las mismas concentraciones en las pruebas a 10 mM de pyrogallol.
Las pruebas realizadas utilizando 30 mM de pyrogallol, en las tres concentraciones de luteína, ficocianina y mezcla, presentaron una marcada actividad antioxidante, lo que indica que, a pesar del aumento en la concentración de pyrogallol; el nivel de bloqueo proporcionado por ficocianina, luteína y mezcla de estas se mantiene su actividad, al menos, en las tres concentraciones de pyrogallol ensayadas en este trabajo. Para la concentración de 100 pg / mL de luteína, ficocianina y mezcla, fue donde la formación de radicales superóxido fue mínima, lo que puede indicar que la ficocianina y luteína actúan como bloqueadores en la reacción de autoxidación de pyrogallol, por lo que puede evitar la formación de radicales superóxido; y en consecuencia, puede inhibir las reacciones de formación de otros radicales, por ejemplo de radicales hidroxilo y perhidroxilo (Guemouri, 1991; Halliwell, 1991; Gil del valle &t al,,
1999). También, cuando el radical superóxido entra en contacto con metales como hierro y cobre forma radicales perferilo y percuprilo, respectivamente (Harman, 1992; Halliwell, 1991, 1995). Por lo anterior se puede deducir que, al menos a concentración de 30 mM de pyrogallol no se produjo una saturación en la formación de radicales superóxido, ya que como se muestrp en la tabla 7.4 al aumentar la concentración de pyrogallol, disminuyó la variación en la absorbancía, por lo tanto, aumentó la cantidad de radicales superóxido formados en el medio de reacción.
Cuadro 7.2 Comparación entre los valores de “d” calculados para luteína, ficocianina y mezcla de estas con respecto al control en el sistema modelo a 10 mM de pyrogallol.
Valores calculados
Luteína Ficocianina Mezcla lut / ficoc
dt 25 pg/mL 1.58 0.69 1.75
d2 50 pg/mL 1.58 0.69 2.63
d3100 pg/mL 3.16 2.07 3.21
Al realizar el ANOVA se observó que la mejor actividad antioxidante ocurrió cuando se usó la mezcla de luteína / ficocianina a las diferentes concentraciones con un grado de confiabilidad del 95%.
También se observó que la actividad antioxidante de la luteína fue mayor que la de ficocianina con un a= 0.05.
Cuando se determinó la capacidad antioxidante de cada una de las concentraciones utilizadas de los diferentes sistemas con respecto al control, se observó que el valor critico de d ^ = d0.os/2 (K, v) = 2.88 (tabla 7.2) fue mayor solo cuando se utilizaron 100 pg / m i en el caso de luteína y de la mezcla en el sistema modelo a 10 mM.
Cuadro 7.3 Comparación entre los valores de “d" calculados para luteína, ficocianina y mezcla de estas con respecto al control en el sistema modelo a 15 mM de pyrogallol. Valor critico para dg/2 (K, v = d0,05/2 (3, 8) = 2.88__________
Valores calculados Luteína Ficocianina Mezcla lut / ficoc
di 25 pg/mL 2.58 1.93 2.05
d2 50 pg/mL 3.87 3.22 3.07
d3100 pg/mL 5.16 4.51 4.10
Cuando al sistema modelo con 15 mM de pyrogallol se le adicionó luteína a 25 pg / mL (tabla 7.3) no se obtuvo un valor calculado mayor al valor critico igual que en el modelo de 10 mM de pyrogallol. Cuando se adicionaron 50 y 100 pg / mL de luteína se presentaron actividades antioxidantes significativas (a= 0.05). Las muestras de ficocianina a 25 pg / mL tampoco presentaron actividades antioxidantes significativas con respecto al blanco (a= 0.05). No así para las concentraciones de 100 pg / mL de ficocianina, ya que el valor del estadístico de prueba fue mayor al valor crítico. En la mezcla de luteína / ficocianina se observó un comportamiento similar a la ficocianina sola para las mismas concentraciones.
Se observa en la tabla 7.4 que cuando se aumento la concentración de pyrogallol; la capacidad antioxidante proporcionada por la ficocianina, luteína y mezcla de estas fue mayor al valor crítico para cada una de estas (a - 0.05). Por lo anterior se puede deducir que, al menos a concentración de 30 mM de pyrogallol no se produjo una saturación en la formación de radicales superóxido, ya que como se mostró en la tabla 7.4 conforme aumentó la concentración de pyrogallol disminuyo la variación en la absorbancia, por lo tanto aumenta la cantidad de radicales superóxido formados en el medio de reacción.
Cuadro 7.4 Comparación entre los valores de “d” calculados para luteína, ficocianina y mezcla de estas con respecto al control en el sistema modelo a 30 mM de pyrogallol. Valor critico para dgj2 (K, v = do.05/2 (3, 8) = 2.88____________ ________
Valores calculados Luteína Ficocianina Mezcla lut/ficoc
di 25 pg/mL 4.61 3.33 4.15
Ú2 50 pg/mL 5.64 4.76 6.06
d3100 pg/mL 6.32 5.24 6.58
De acuerdo a los diferentes sistemas probados podemos decir que la mejor concentración en el caso de luteína fue de 100 pg / m!_ ya que presentó mayor actividad antioxidante para cada uno de los sistemas con un grado de confiabilidad del 95%. También de podría usar 50 pg / ml_ pero en sistemas mayores a 10 mM de pyrogallol.
Se observó que la mayor capacidad antioxidante de acuerdo a los valores calculados de “d" fueron mas altos cuando se utilizó la mezcla luteína / ficocianina a concentración de 50 y 100 pg / mL para cada uno de las concentraciones de pyrogallol. Resultados que fueron similares a los observados en el ANOVA realizado previamente, donde se propuso la existencia de un efecto sinèrgico.
Adicionalmente, conforme la concentración de pyrogallol aumenta, el nivel de bloqueo de la oxidación -debido a la presencia de ficocianina, luteína y la mezcla de estos- se mantiene constante. Esto puede deberse a que, en el caso de la luteína, esta pudiera actuar por un mecanismo físico antioxidante, el cual ha sido reportado por Di Macio (1991). Y propone que, al entrar en contacto el antioxidante con el radical superóxido, este se desactiva debido a la transferencia de energía de dicho radical al carotenoide, produciendo el compuesto llamado carotenoide tripleto excitado, el cual puede o no volver a oxidarse para formar otro tipo de radicales o formar grupos hidroxilos, los, cuales no se encuentran excitados, por consiguiente podrían estar exentos a oxidarse nuevamente, a menos que se unan con un radical peroxidrilo o peróxido.
De acuerdo a su estructura química, la ficocianina podría actuar como antioxidante primario, para prevenir la formación de nuevos radicales libres. Los radicales superóxido se pueden “aparear” con los grupos oxigeno que se encuentran unidos en doble enlace a la cadena tetrapirrolica, de esta manera se podría formar un complejo radical-cadena tetrapirrolica.
7.7 Actividad antioxidante en un modelo fisiológico in vitro