1.4.1.- ACTIVIDAD BACTERICIDA DE MONÓMEROS.
La actividad bactericida de los distintos monómeros se determina mediante dos métodos distintos de difusión sobre agar en placa. Como cultivos modelo se usan las cepas Escherichia coli (DH5α) como Gram-negativa y Streptococcus mutans (CECT 479), como Gram-positiva. Ambos cultivos se preservan almacenándolos a -80 ºC en mezclas de glicerina agua (20% v/v).
Los monómeros a ensayar son metacrilato de etilo (EMA), metacrilato de 2- hidroxietilo (HEMA), metacrilato de eugenilo (EgMA) y metacrilato de etoxieugenilo (EEgMA). Se preparan disoluciones de cada uno de ellos en concentración 1M, en tres disolventes distintos: DMSO, cloroformo, y Tween 20 al 10% p/v en agua. Además, dado la conocida actividad bactericida del eugenol11, , 12 13 se preparan sendas disoluciones adicionales de éste que se usan como control positivo.
Todos los experimentos se realizan por triplicado para constatar la repetitividad del método. Los medios de cultivo que se usan para el cultivo de los microorganismos son el BHI (Caldo de corazón y cerebro, Laboratorios Difco, USA) y el medio de Luria (LB, extracto de levadura (0,5%), triptona (1%) y NaCl (1%), Difco, USA).
Para llevar a cabo los experimentos, se hacen crecer por separado ambas cepas bacterianas en 5 ml de medio de cultivo BHI durante 12 horas a 37 ºC obteniéndose así un cultivo en fase estacionaria con el que se inicia los experimentos. Tras ese tiempo, mediante un colorímetro (Boecos-22 Spectrophotometer, Germany) se mide la absorbancia a 600 nm del cultivo. Para ajustar el valor del número de bacterias viables se determina el número de unidades formadoras de colonias (UCF) de suspensiones con
distintas densidades ópticas, mediante técnicas estandarizadas de conteo sobre placas de medio-agar.
El agar es un polisacárido que en presencia de agua adquiere un estado gelatinoso que se extrae de un alga marina y es usado rutinariamente como sustrato de cultivos bacterianos.14 Tiene como ventaja que una vez esterilizado a 120 ºC en autoclave permanece líquido hasta enfriarse aproximadamente hasta los 50 ºC. En este rango, se puede manipular fácilmente y se le puede añadir los distintos microorganismos para después dejar enfriar y obtener un sólido gelatinoso con el cultivo inmovilizado.
Para determinar el número de unidades formadoras de colonias se preparan diluciones 1/10, 1/100 y 1/1000 de los cultivos estacionarios con las que se llevan a cabo los distintos ensayos. Se toman aproximadamente 1,5 ml de ellas y se añaden sobre 150 ml de una mezcla en caliente de medio de cultivo-agar (2%) previamente esterilizado en autoclave. Antes de que la mezcla solidifique, cada mezcla cultivo-agar- medio se extiende sobre tres palcas petri y se dejan solidificar siempre en el interior de una cabina de flujo laminar para evitar contaminaciones.
El primer experimento se realiza mediante el llamado método placa-pocillo15 (hole-plate method). Para ello, una vez que gelifica toda la mezcla, se realiza una perforación por cada disolución a ensayar (EMA, EgMA, EEgMA, eugenol, HEMA) con un pequeño taladro esterilizado. Se toman las disoluciones preparadas en DMSO y se depositan en cada taladro 40 µl de cada disolución correspondiente. En un taladro central se introducen 40 µl de DMSO para descartar posibles efectos inhibitorios debidos a éste. El mismo experimento se realiza con las disoluciones preparadas en cloroformo y en Tween 20.
Tras inocular las disoluciones a ensayar las placas se cierran y se cultivan durante 24 horas a 37 ºC. La actividad inhibitoria de cada compuesto se determina en función de la presencia de halo de inhibición en los alrededores de los taladros. La formación del halo se debe a la ausencia de formación de colonias. Los resultados de este experimento se expresan como diámetro medio del halo en milímetros.
Este experimento se realiza paralelamente con los microorganismos cultivados en medio LB.
De manera complementaria se realiza otro tipo de experimento consistente en la preparación de antibiogramas por el método de difusión sobre agar.16 Para ello se preparan placas de agar con medio de cultivo LB según se describe arriba, pero sin la adición de ninguna cepa bacteriana. Cuando las placas están frías y el agar endurecido se extienden sobre la superficie de placas diferentes para cada cultivo, con la ayuda de una espátula estéril, las diluciones 1/10 de los cultivos preparados previamente. A continuación se depositan sobre la superficie 5 discos especiales para antibiogramas (Schleicher & Schüll), empapados de las disoluciones a ensayar. Estas disoluciones son el blanco (DMSO), y las correspondientes a los monómeros HEMA, EgMA y EEgMA, así como del eugenol en DMSO en concentración 1M. Tras esto, las placas se cierran y se cultivan durante 24 horas a 37 ºC. La actividad inhibitoria de cada compuesto se determina en función de la presencia de halo de inhibición en los alrededores de los discos que indican la ausencia de formación de colonias. Los resultados de este experimento se expresarán como diámetro medio del halo en milímetros.
1.4.2.- ACTIVIDAD BACTERICIDA DE POLÍMEROS.
La actividad bactericida de los distintos materiales poliméricos se determina mediante la técnica de extensión de una colonia sobre placa de agar y determinación de la actividad bactericida de los materiales por inhibición por contacto. En este experimento se usan los microorganismos y medios de cultivos descritos en el apartado anterior. Los polímeros estudiados son los derivados de los metacrilatos de eugenilo, etoxieugenilo y 2-hidroxietilo, sintetizados en masa según se escribe en el apartado 1.2.2. Como control negativo se usan discos de metacrilato de 2-hidroxietilo ya que estos no poseen ningún carácter inhibitorio. Las composiciones ensayadas son las de relación molar 80:20 y 50:50 de los copolímeros p(HEMA-co-EgMA) y p(HEMA-co- EEgMA).
Para llevar a cabo el experimento se preparan suspensiones de microorganismos igual que las preparadas en el apartado 1.4.1. A continuación se preparan 9 placas agar- LB y se dejan enfriar en condiciones estériles. De este modo se disponen de tres placas
por cada suspensión de trabajo. Una vez frías se depositan sobre cada una de ellas, en posiciones distintas, cinco gotas de 2 µl de las respectivas suspensiones de trabajo de las bacterias. Se dejan absorber dichas gotas sobre el sustrato de agar durante 2 horas para después depositar sobre las gotas un disco de cada material. A continuación se deja crecer el cultivo en estufa a 37 ºC durante 48 h tomándose fotografias de las placas tanto a 24 como a 48 h.