La determinación del peso molecular es, por otro lado, poco compleja mediante
6) Afinidad por otras proteínas: como albúmina e interferon específicamente u otros
grupos de proteínas como proteínas de membrana, neurotransmisores,
factores de coagulación, factores de crecimiento, etc.
Esta técnica también se puede utilizar para la separación de otros tipos de
Basado en la superficial de la proteína, en este método se aplica un gradiente de pH, de manera que la carga de las moléculas está continuamente cambiando a medida que varía el pH, provocando la elución de las proteínas desde la resina a medida que alcanzan su punto isoeléctrico, es decir, el pH que neutraliza su carga superficial. Este método suele ser muy específico pero presenta el problema de que se tiene que trabajar a un pH correspondiente al de cada una de las proteínas que contiene al mezcla a tratar, y esto puede afectar mucho a proteínas que sean sensibles a variaciones importantes del pH.
Los rellenos utilizados son similares al caso de la cromatografía de intercambio amónico. El proceso implica empezar con un pH elevado superior al de las proteínas de la mezcla para posteriormente ir disminuyendo este pH y las proteínas cuando se alcance cada punto isoeléctrico. Este método es aplicable para mezclas de proteínas de características conocidas (Lee et 1997; Alfonzo eí 1997).
1.3.4.
La electroforesis se define como la migración de macromoléculas cargadas bajo la influencia de un campo eléctrico, y suele emplearse casi siempre a escala de laboratorio con fines analíticos o de caracterización. Normalmente, se usa una solución de elevada fuerza iónica para concentrar e inmovilizar las proteínas, y se aplica una diferencia de potencial al gel que contiene las proteínas que migraran en función de su carga o de su peso molecular si previamente han sido igualadas las cargas.
El método más popular de electroforesis de una dimensión es el conocido por SDS-
PAGE ("Sodium dodecyl gel usado para la
determinación de pesos moleculares de macromoléculas como las proteínas, que una vez dotadas de una carga equivalente, migran bajo la acción de un campo eléctrico sobre un gel en función de su tamaño molecular. Los pesos moleculares de las proteínas se determinan por comparación de sus movilidades con algunos marcadores de peso molecular conocido.
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Otro método utilizado frecuentemente es el denominado Isoelectroenfoque, en esta técnica, cuando una proteína es introducida en un medio de pH variable bajo la influencia de
un campo eléctrico, se mueve hacia el polo opuesto a su pero en su migración a través
del gradiente de pH, la proteína puede ganar o perder protones, de manera que su carga disminuirá y perderá movilidad, llegando hasta el punto en que el pH iguale su punto isoeléctrico. Sus aplicaciones en el campo de la caracterización de proteínas en todas sus
variedades y posibilidades son muy numerosas Riguetti, 1990).
1.3.5. Electroforesis capilar
La electroforesis capilar (CE) se define como una técnica de alta resolución para la separación de una amplia gama de moléculas de interés biológico como metabolitos, aminoácidos, ácidos nucleicos, glúcidos, proteínas y péptidos, aunque su mayor aplicación actualmente está en el campo del análisis de cationes y aniones (Fung y Lau, 1998a; Fung et al, 1998b).
Al igual que en el caso de la electroforesis en gel, las separaciones en CE se basan en
la relación La CE emplea columnas capilares de sílice que pueden ser o no
derivatizadas por donde las proteínas se mueven en solución. Esta técnica puede utilizarse a modo de electroforesis en gel para determinar los pesos moleculares de las proteínas o bien, para conocer los puntos isoeléctricos de dichas proteínas. En este último caso, conocido como isoelectroenfoque, la proteína se desplaza cuando se crea un gradiente de pH en la columna
hasta pararse en el punto en el que en pH es igual al Tras esto, la muestra se moviliza
rompiendo el gradiente de pH o hidrodinámicamente, obteniéndose picos parecidos a los
obtenidos mediante las técnicas tipo FPLC y
En su forma más simple, la separación mediante CE se consigue pasando un voltaje entre dos recipientes llenos de algún tampón que están unidos por un capilar también lleno de líquido (Fig. 1.6). Esto produce la generación de lo que se conoce por flujo electroosmótico, que permite a las moléculas de interés pasar de un extremo del capilar al otro. En el caso del isoelectroenfoque, la forma más común de operar es situar en cada extremo del capilar una solución de pH ácido y básico respectivamente, aplicar potencial para crear un gradiente de
pH a lo largo del capilar que permita a las moléculas, en este caso proteínas, moverse hasta alcanzar el pH correspondiente a su punto isoeléctrico, en el que dejarán de moverse. En este punto, se iguala el pH de cátodo y ánodo situando el mismo compuesto (ácido o base) en cada extremo de la columna, de manera que se rompe el gradiente de pH, y las proteínas salen de la
columna consecutivamente por su de acuerdo a como se hayan distribuido en la primera
fase (Coligan et 1995).
Los capilares utilizados tienen generalmente de 30 a 50 cm de largo con 50-75 de
diámetro interno, lo que supone volúmenes del orden de microlitros. Los capilares tienen un grosor muy pequeño, lo que permite una efectiva eliminación del calor generado por los voltajes que normalmente alcanzan los 30 kV, necesarios para este tipo de separaciones. Los capilares pueden estar vacíos (normalmente en el caso del análisis de iones) pero para proteínas se recomienda el uso de capilares rellenos de los cuales en el mercado se encuentran distintos tipos cuyas diferencias suelen ser de
Capilar
\
Detector
Voltaje
Introducción 25
Aunque la CE ha sido aplicada con éxito en la resolución de algunas proteínas (Jin et al, 1997; Park et 1997; Magnuson y Crawford, Xu et 1997), el hecho de que esta técnica sea una de más difíciles de optimizar para tener buenas separaciones en mezclas complejas como las que provienen habitualmente de caldos de fermentación, ha provocado no sea todavía un sistema de separación común en biotecnología, aunque sin embargo, es una herramienta útil en la determinación cuantitativa rápida de la pureza de ciertas muestras.