Aislamiento bioguiado de compuestos activos presentes en los aceites esenciales

A fin de determinar cuales eran los compuestos responsables de la actividades detectadas se realizó una reacción de fluoración del 1-alil-4-metoxibenceno (metilchavicol) el cual se ha reportado como uno de los constituyentes principales de los aceites esenciales de A. dracunculus145 y O. basilicum146 (este hecho fue corroborado durante el análisis por CG-EM de estos dos AEs antes de la reacción de fluoración). Al comparar los perfiles bioautográficos

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Resultados y Discusión

131 de los aceites esenciales modificados y de la mezcla de productos de la fluoración del metilchavicol con Selectfluor® se observaron halos a iguales Rfs indicando que los compuestos activos podrían haber sido generados a partir de la fluoración del metilchavicol. Por lo tanto, se realizó el fraccionamiento de esta mezcla de productos de reacción mediante cromatografía en columna de sílica gel empleando gradiente de Hexano:AcOEt bioguiada por la autografía para la detección de inhibidores de tirosinasa.132 En esta etapa se obtuvieron 10 fracciones (F1-F10), resultando activas las fracciones F2, F3 y F5. En las fracciones F2 y F3, se identificaron dos compuestos que son productos de la sustitución aromática del metilchavicol, 1-alil-2-fluoro-4-metoxibenceno (4) y 4-alil-2-fluoro-1-metoxibenceno (5, Figura 77), respectivamente. En tanto que en la fracción F5, se identificó un tercer compuesto, 4-alil-4-fluorociclohexa-2,5-dienona, producto de un proceso de adición eliminación147 que cursa sobre metilchavicol (6, Figura 77). Los mismos fueron elucidados utilizando EMAR, CG-EM y RMN (1H, 19F, HSQC (editado en DEPT), HMBC, DEPT, 1H-

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HCOSY y DEPT).

Figura 77. Compuestos responsables de la actividad inhibitoria de tirosinsa presentes en los AEFs de A. dracunculus y O. basilicum.

El espectro de RMN de 1H del compuesto 4 (Figura 78) presentó una integración total para 11 H, a campos bajos mostró la presencia de un multiplete en δH 6,86 ppm (2H)

correspondientes a los protones en posición 3 y 6 del anillo benceno y otro multiplete en δH

6,76 ppm (1H), correspondientes al protón en posición 5 del mismo anillo. Se evidenciaron además dos multipletes en δH 5,96 ppm (1H, -CH=) y en δH 5,07 ppm (2H, =CH2)

correspondientes a los protones del grupo vinilo (estos protones pertenecen a un sistema ABX, debido a la complejidad de las señales y a la insuficiente resolución no se pudieron establecer las multiplicidades y acoplamientos). Además se observó un singlete con δH 3,80

ppm con integración para 3H correspondiente a los protones del grupo metoxilo. A campos más altos, δH 3,36 ppm se evidenció un doblete (3JH-H =6,6 Hz), con integración para 2

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protones, correspondiente al metileno del grupo alilo. La señal del protón con δH 5,96 ppm

presento correlación en el experimento de 1H-1H COSY con las señales con δH 5,07 ppm y δH

3,36 ppm, evidenciando la vecindad de estos grupos.

Figura 78. Espectro de RMN de 1H (desde 7,10 ppm a 3,20 ppm) de 1-alil-2-fluoro-4-metoxibenceno (compuesto 4).

Los espectros de RMN (Anexo IV) de 13C, 13C DEPT, HSQC (editado DEPT) y HMBC indicaron la presencia de 10 C. Se presentó una señal a δC 157,0 ppm (d, J=237,8 Hz)

correspondiente al carbono sustituido con flúor del anillo benceno (C2). Los carbonos cuaternarios sustuidos con grupo alilo (C1) y metoxilo (C4), presentaron desplazamientos químicos de δC 130,4 ppm y δC 153,4 ppm, respectivamente. En el espectro de HSQC (editado

en DEPT) (Figura 79) se observaron además los carbonos correspondientes a las posiciones 5, 3 y 6 del anillo benceno con desplazamientos químicos de δC 111,1 (d, J=8,3 Hz), 112,8

ppm (d, J=22,7 Hz), y 116,5 (d, J=23,2 Hz), respectivamente. En desplazamientos de δC 136,1

ppm (CH=), δC 116,1 ppm (=CH2) y δC 34,0 ppm (-CH2-); se observaron las señales

correspondientes a los carbonos vinílicos y al carbono metilénico del grupo alilo. Se observó a campos altos una señal δC 55,9 ppm correspondiente al carbono del grupo metoxilo.

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133 Figura 79. Espectro de HSQC (editado en DEPT) ampliado (desde 6,90 a 6,65

ppm para F2 y 123,1 a 105,3 ppm para F1) de 1-alil-2-fluoro-4-metoxibenceno (compuesto 4).

Por su parte en el espectro de RMN de 19F se observó una señal con δF -124,30 ppm,

evidenciando la presencia de este átomo en la estructura propuesta. Además la fórmula química C10H11OF fue verificada mediante EMAR, [M+Na] de m/z = 189,0686 (requerido,

m/z =189,0686, error = 0,3 ppm).

El espectro de RMN de 1H del compuesto 5 (Figura 80) presentó una integración total para 11 H, a campos bajos mostró la presencia de un multiplete en δH 6,92 ppm (1H)

correspondiente al protón en posición 3 del anillo benceno y otra señal multiplete en δH 6,88

ppm (2H), correspondientes a los protones en posición 6 y 5 del mismo anillo. Se evidenció además dos multipletes en δH 5,92 ppm (1H, -CH=) y en δH 5,06 ppm (2H, =CH2)

correspondientes a los protones del grupo vinilo (Estos protones pertenecen a un sistema ABX, debido a la complejidad de las señales y baja resolución no se pudieron establecer las multiplicidades y acoplamientos). Además se observó un singlete con δH 3,86 ppm con

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δH 3,31 ppm se evidenció un doblete (3JH-H =6,6 Hz), con integración para 2 protones,

correspondiente al metileno del grupo alilo. La señal del proton con δH 5,92 ppm presento

correlación en el experimento de 1H-1H COSY con las señales con δH 5,06 ppm y δH 3,31

ppm, evidenciando la vecindad de estos grupos.

Figura 80. Espectro de RMN de 1H (desde 7,10 ppm a 3,20 ppm) de 4-alil-2-fluoro-1-metoxibenceno (compuesto 5).

Por su parte, los espectros de RMN (Anexo V) de 13C, 13C DEPT, HSQC (editado DEPT) y HMBC indicaron la presencia de 10 C. Se presentó una señal a δC 152,3 ppm (d,

J=245,3 Hz) correspondiente al carbono sustituido con flúor del anillo benceno (C2). Los carbonos cuaternarios sustuidos con grupo alilo (C4) y metoxilo (C1), presentaron desplazamientos químicos de δC 133,2 ppm y δC 145,8 ppm, respectivamente. En el espectro

de HSQC (editado en DEPT) (Figura 81) se observaron además los carbonos correspondientes a las posiciones posición 6, 3 y 5 del anillo benceno con desplazamientos químicos de δC 113,5 ppm (d, J=3,4 Hz), 116,5 ppm (d, J=18,1 Hz) y 123,9 ppm (d, J=3,43

Hz), respectivamente. En desplazamientos de δC 137,0 ppm (CH=), δC 116,1 ppm (=CH2) y δC

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135 carbono metilénico del grupo alilo. Se observó a campos altos una señal δC 56,4 ppm

correspondiente al carbono grupo metoxilo.

Figura 81. Espectro de HSQC (editado en DEPT) ampliado (desde 7,00 a 6,80 ppm para F2 y 130,7 a 107,9 ppm para F1) de 4-alil-2-fluoro-1-metoxibenceno (compuesto 5).

Por su parte en el espectro de RMN de 19F se observó una señal con δF -135,5 ppm,

evidenciando la presencia de este átomo en la estructura propuesta. Además la fórmula química C10H11OF fue verificada mediante EMAR, [M+Na] de m/z = 189,0688 (requerido,

m/z =189,0686 error = -1,2 ppm).

El espectro de RMN de 1H del compuesto 6 (Figura 82) presentó una integración total para 9 H, a campos bajos mostró la presencia de un doble doblete en δH 6,86 ppm (2H, 3JH-H=

10,2 Hz, 3JH-F =6,2) correspondientes a los protones en posición 3 y 5 de la ciclohexadienona

y otra señal en δH 6,23 ppm (m, 2H, 3JH-H =10,2 Hz), correspondientes a los protones en

posición 2 y 6 del mismo anillo. Se evidenció además la presencia de dos multipletes en δH

5,70 ppm (1H, -CH=) y en δH 5,18 ppm (2H, =CH2) correspondientes a los protones del grupo

vinilo (estos protones pertenecen a un sistema ABX, debido a la complejidad de las señales y baja resolución no se pudieron establecer las multiplicidades y acoplamientos). A campos más

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altos, δH 2,64 ppm se evidenció un doble doblete (2H, 2JH-H=16,2 Hz, 3JH-H =7,2 Hz), con

integración para 2 protones, correspondiente al metileno del grupo alilo. La señal del protón con δH 5,70 ppm presentó correlación en el experimento de 1H-1H COSY con las señales con

δH 5,18 ppm y δH 2,64 ppm, evidenciando la vecindad de estos grupos.

Figura 82. Espectro de RMN de 1H (desde 7,10 ppm a 3,10 ppm) de 4-alil-4-fluorociclohexa-2,5-dienona (compuesto 6).

Los espectros de RMN(Anexo V) de 13C, 13C DEPT, HSQC (editado DEPT) y HMBC indicaron la presencia de 9 C. Se presento una señal a δC 184,8 ppm (d, J=5,48 Hz)

correspondiente al grupo cetona de la dienona, la misma presenta correlación a 3 enlaces en el espectro de HMBC con los protones de δH 6,86 ppm, antes mencionados. Se observaron

además los carbonos correspondientes a las posiciones 3 y 5 de la ciclohexadienona con un δC

145,5 ppm (d, J=21,28 Hz); y con un δC 129,5 ppm (d, J=6,53 Hz) los correspondientes a las

posiciones 2 y 6. En desplazamientos de δC 129,6 ppm (CH=), δC 121,0 ppm (=CH2) y δC 43,3

ppm (-CH2-); se observan las señales correspondientes a los carbonos vinílicos y el carbono

metilénico del grupo alilo. El carbono cuaternario en posición 4 de la ciclohexadienona sustituido con fluor presentó un δC 88,3 (d, J=166 Hz).

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137 Por su parte en el espectro de RMN de 19F se observó una señal con δF -150,90 ppm,

evidenciando la presencia de este átomo en la estructura propuesta. Además la fórmula química C9H9OF fue verificada mediante EMAR, [M+Na] de m/z = 175,0524 (requerido, m/z

=175,0530, error = 0,2 ppm).

Con el objetivo de verificar que los compuestos activos aislados 4-6 estuvieran presentes en los aceites esenciales fluorados de A. dracunculus y O. basilicum, se realizaron CG-EM de ambos AEFs y de los tres compuestos aislados. El compuesto 6 presenta un tiempo de retención de 10,8 min (Figura 83c) y se encuentra en ambos aceites esenciales en una proporción muy baja (Figura 83a y b). Por su parte, los compuestos 4 y 5 poseen tiempos de retención muy similares entre sí (tR 15,8 min y tR 15,7 min, respectivamente; Figura 83d y

e) y por lo tanto sus picos cromatográficos aparecen superpuestos en los cromatogramas de los aceites esenciales fluorados dando lugar a un pico ensanchado que no permite la confirmación de la presencia de ambos (Figura 83a y b). Sin embargo esta confirmación provino de los datos de RMN 19F: en los espectros de los AEFs de A. dracunculus y de O. basilicum se observaron las señales a δF -124,30 ppm y -135,5 ppm que corresponden a los

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Figura 83. Cromatogramas obtenidos mediante CG-EM (a) aceite esencial modificado de A. dracunculus, (b) Aceite esencial modificado de O. basilicum, (c) compuesto 6, (d) compuesto 4 y (e) compuesto 5.

A fin de cuantificar la actividad inhibitoria de la enzima tirosinasa se realizaron ensayos en microplaca de ácido kójico, de los compuestos 4-6 y de su precursor el metilchavicol. El metilchavicol resultó ser inactivo en el rango de concentraciones testeado, en tanto que los compuestos 4 (CI50 =97,48 µM) y 5 (CI50 =174,20 µM) resultaron débiles

inhibidores. El resultado más destacado fue el obtenido para el compuesto 6 para el que se determinó un valor de CI50 de 59,14 µM, este compuesto semisintético presenta una actividad

similar a la reportada para uno de los inhibidores de referencia para este blanco terapéutico como es el ácido kójico el cual presentó, en las mismas condiciones de experimentación, un valor de CI50 de 42,16 µM.