AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE ARN.

Extracción de ARN por Tripure:

El ARN total fue extraído utilizando el método Tripure Isolation Reagent (Roche Diagnostic) según las instrucciones de la casa comercial. Las muestras fueron homogenizadas con Tripure (1 ml de tripure por cada 100 gramos de tejido) haciendo uso de un homogenizador de palas, de manera que el tripure permitía la lisis de las estructuras celulares manteniendo la integridad del ARN. En las muestras de tejido adiposo se realiza un paso previo que consiste en una centrifugación a 1200 g durante

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10 min a 4 ° C con el fin de eliminar la grasa, en otros tejidos no hace falta este paso. Para la separación del ARN se añade 200 µl de clorofomo (Sigma) a las muestras y se agita vigorosamente durante 15 segundos. Seguidamente las muestras se incuban en frío durante 2-15 min y posteriormente se centrifugan a 1200 g durante 15 min. Recogiendo la fase acuosa superior que contiene el ARN, mientras que la fase inferior que contiene las proteínas y el ADN se guarda a - 20 ° C. Para la precipitación del ARN se añade 500 µl de isopropanol (Sigma) y se mezcla ligeramente por inmersión, manteniéndose al menos 1 hora en frío o durante toda la noche a - 20 ° C. Posteriormente, las muestras se centrifugan a 1200 g durante 15 min para obtener el precipitado de ARN. Se descarta el isopropanol y el precipitado de ARN se limpia añadiendo 1 ml de etanol al 75 % (Panreac) agitándolas vigorosamente durante 15 segundos. Después se centrifugan las muestras a 7600 g durante 5 min y se elimina completamente el etanol. Una vez eliminado el etanol el ARN se resuspende en un volumen apropiado (20 - 200 µl) de agua libre de ARNasas (Sigma) según la cantidad de precipitado obtenido. Para facilitar la resuspensión del ARN, las muestras se calientan en un termoblocker a 60 ° C. El ARN extraído se guarda a - 80 ° C para su conservación.

Reactivos:

- Tripure Isolation Reagent (Roche Diagnostic cod 11 667 165 001) - Clorofomo (Sigma cod C2432)

- Isopropanol (Sigma cod I9516) - Etanol (Panreac cod 121085)

- Agua libre de ARNasas (Sigma cod W4502) - Agarosa (Pronadisa cod 8016)

- Syber Safe (Invitrogen cod S33102)

Extracción de ARN por columnas:

El ARN total fue extraído utilizando el método de extracción por columnas (Kit E.Z.N.A TM EaZy Nucleic Acid Isolation) según las instrucciones de la casa comercial. Las muestras fueron homogenizadas con TRK Lysis Buffer (entre 300- 700 µl según el tejido a homogenizar) La homogenización se realiza en tubos eppendorf de 2 ml. Una vez las muestras están homogenizadas se realiza una centrifugación a 13000 g durante 5 min. Después hay que transferir el sobrenadante con la pipeta a un eppendorf de 1,5 ml. Se añade 300-700 µl (según tejido) de etanol al 70 % al sobrenadante y se vortea. Posteriormente se introduce todo el volumen en una columna HiBind® RNAspin con un tubo colector de 2 ml. Y se centrifuga 10000 g durante 1 min. Después se descarta el eluyente (lo que queda en el tubo colector). Como la columna sólo acepta un máximo de 750 µl a la columna se hace en dos veces la centrifugación (cargando 750 µl la primera vez y el resto la segunda). Nuevamente se coloca la columna en un nuevo tubo colector de 2 ml y se la lava la columna con 350 µl de RNA Wash Buffer I y se centrifuga a 10000 g durante 1 min y se descarta el eluyente. Después se agrega directamente sobre la superficie de la columna 35 µl de solución de DNasa I (por cada muestra: 36,75 µl de E.Z.N.A TM Dnasa Digestion Buffer + 0,75 µl de RNasa free DNasa I). Se deja reposar a temperatura ambiente durante 15 min. Posteriormente se añade 400 µl de RNA Wash Buffer I, se espera 2 min y posteriormente se centrifuga a 10000 g durante 1 min. Después de la centrifugación se descarta el eluyente. Seguidamente se añade 500 µl de RNA Wash Buffer II (previamente diluido con etanol 96 % como indica la casa

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comercial) invertiendo los tubos varias veces suavemente y se centrifuga a 10000 g durante 1 min. Después de la centrifugación se descarta el eluyente. Nuevamente se añade 350 µl del RNA Wash Buffer II y se centrifuga a 10000 g durante 1 min. Posteriormente a la centrifugación se descarta el eluyente. Seguidamente se centrifugan las columnas con tubos colectores vacíos a velocidad máxima de 20000 g durante 2 min. Finalmente se colocan las columnas en un eppendorf de 1,5 ml y se añade de 20-40 µl de DEPC-Treated Water (según el tejido) directamente sobre la superficie de la membrana y se centrifuga a 10000 g durante 2 min y el eluyente obtenido es el RNA total purificado.

Reactivos:

- Kit E.Z.N.A TM EaZy Nucleic Acid Isolation (Total RNA Kit) (R6834-02)

El ARN se cuantifica por espectoformetría usando el espectofotómetro NanoDrop ND-100, usando 2 µl de muestra y valorando la absorbancia de las muestras a 260 nm. Para valorar la pureza del ARN se mide el ratio 260/280 nm, que determina el grado de contaminación por proteínas y el ratio 260/230 nm determina el grado de contaminación por solventes orgánicos.

La integridad de las muestras se carga 0,5 µg de ARN previamente mezclados con tampón de carga en un gel de agarosa al 1 % (Pronadisa) con Syber Safe (Invitrogen). La visualización de las dos bandas correspondientes a los ARNs ribosomales 28S y 18S son indicativos de un ARN en buen estado.

22. RT-PCR.

Para la determinación de los niveles de expresión de mRNA de los genes de interés se utilizó la técnica RT-qPCR.

Retrotranscripción: se usaron 0,25 µg de ARN que se llevó a un volumen de 5 µl con agua libre de ARNasas (Sigma) y se desnaturaliza a 65 ° C durante 10 minutos en el termociclador Thermal Cycler 2720 (Applied Biosystems). Después de la desnaturalización, a las muestras se le añaden 7,5 µl de una RT-mix preparadas para que las concentraciones agregar en cada muestra sean: 1 µl de 10x buffer (Promega), 2,5mM de MgCl2 (Promega), 0,4 mM de nucleótidos (Invitrogen), 5 µM de random hexamers (Applied Biosystems), 5 µM de inhibidor de ARNasas (Applied Biosystems) y 2,5 U/µl de transcriptasa inversa (MuLV RT, murine leukemia virus reverse trasncriptase, Applied Biosystems). Las condiciones de la reacción: 15 min a 20 ° C, 30 min a 42 ° C, 5 min a 95 ° C e indefinidamente a 4 ° C.

Reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real: se utiliza 2 µl del producto de RT diluido (entre 1/5 a 1/50 dependiendo del gen a determinar). A los 2 µl de muestra se le añade 9 µl de la mezcla PCR-mix que contiene: 3,1 µl de agua libre de ARNasas, 0,475 µl de cada cebador (a una concentración que depende de la abundancia de cada ARNm en un tejido específico, entre 5-20 µM) y 5 µl de Power SYBR Green

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PCR Master Mix que contiene el fluoróforo necesario para la detección. La reacción de PCR se realizó en el termociclador StepOnePlus TM (Applied Biosystems) y consiste en: una desnaturalización a 95 ° C durante 10 min, seguido por entre 40-50 ciclos (dependiendo del gen analizar) de temperatura, concretamente 15 s a 95 ° C (condiciones de desnaturalización) seguido de 1 min a 60 ° C (condiciones de elongación). Con el objetivo de verificar los productos obtenidos se realiza una curva de desnaturalización después de cada PCR siguiendo las instrucciones de la casa comercial. La correspondencia del fragmento amplificado con el mRNA de interés se verifica mediante la realización de un gel de agarosa al 1,5 % teñido con Syber Safe (Invitrogen), comparándolo con el tamaño del amplicón. Las imágenes de captan con el programa Gene Snap y las bandas se cuantifican con el programa Gene Tools.

Reactivos:

- Agua libre de ARNasas (Sigma cod W4502) - 10 x Buffer (Roche cod 11699105001) - MgCl2 (Roche cod 1169911300)

- Nucleótidos (solución dATP, dTTP, dGTP, dCTP) (Invitrogen cod 550852, 55085, 55084, 56173; respectivamente)

- Random hexamers (Applied Biosystems cod S06405), - Inhibidor de ARNasas (Applied Biosystems cod S11002)

- Transcriptasa inversa (MuLV RT, murine leukemia virus reverse trasncriptase) (Applied Biosystems cod S16972)

- Syber Safe (Invitrogen cod S33102) - Agarosa (Pronadisa cod 8016)

- Tampón de carga (50 % glicerol (Sigma cod G2025)/50 % agua/ 2,5 mg/ml azul de bromofenol (Panreac cod 131165)