Aislamiento de microorganismos amilolíticos termófilos

Luego de hacer el procesamiento 18 muestras provenientes de las pilas 1 y 2, se lograron aislar 8 microorganismos diferentes, que incluían bacterias filamentosas y no filamentosas. Todas ellas con actividad amilolítica, en la tabla Nº 5 se describen las características micro y macroscópicas.

Las poblaciones predominantes fueron microorganismos Gram positivos con morfologías bacilares y filamentosas, pertenecientes al grupo de los actinomycetes. Los actinomycetes han sido descritos como microorganismos altamente facultados para sobrevivir en compost en condiciones aerobias y en presencia de materia orgánica contenida en una gran variedad de sustratos orgánicos. Su alta capacidad para habitar ambientes como el suelo o compost, está relacionada con la producción de enzimas extracelulares, que le permiten utilizar una gran variedad de sustratos como fuente energética (Ballows, 1991; Atlas y Bartha, 1987).

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Tabla Nº 5: Características morfológicas de las cepas con actividad amilolítica obtenidas durante el asilamiento primario.

Cepa Microscopía Macroscopía

AA1 Filamentos delgados Gram

positivos Esporas

Colonias secas y pulverulentas de color blanco. Envés de color café.

AA2 Bacilos cortos Gram positivos Colonia redondas, pequeñas, cremosas

con bordes traslúcidos

AA3 Bacilos delgados, medianos Gram

positivos

AA4 Filamentos delgados y esporas

Gram positivos

Colonias blancas corrugadas con bordes traslúcidas

AA5 Filamentos delgados Gram

positivos

Colonias secas, corrugadas, de color blanco.

AA6 Filamentos delgados y cortos Gram

positivos

Colonias puntiformes, pulverulentas de color blanco en el centro y borde traslúcido.

AA7 Bacilos largos Gram positivos Colonias redondas cremosas, de color crema en el centro y bordes traslúcidos

AA8 Bacilos largos Gram positivos Colonias redondas, cremosas de color

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Fig. 5. Microscopía de la cepa AA5.

(Fuente: Autores)

Los otros microorganismos aislados, presentaron una morfología bacilar, correspondiente al género Bacillus sp, reconocido por su capacidad de degradar múltiples sustratos dentro de los que se encuentra el almidón, y varias especies, son a menudo encontradas durante procesos de compostaje, debido a su tolerancia a altas temperaturas (Quinceno, 1989).

Luego de hacer los pases en agar almidón 1% (p/v) por triplicado, se obtuvieron tan solo 5 microorganismos puros, que conservaron sus características tanto microscópicas como macroscópicas y la actividad amilolítica. Las cepas recuperadas fueron AA1, AA2, AA3, AA4 y AA5.

Posteriormente se midieron los halos de hidrólisis de cada uno de los microorganismos aislados. Los resultados se muestran en la Tabla Nº6 y en la Fig. 6 los halos de hidrólisis generados por las cepas AA1 y AA2 respectivamente.

Debido a que tres de los microorganismos asilados en el aislamiento primario no se pudieron recuperar, se dejaron las cinco cepas restantes para producir el inoculante mixto. Al hacer la medición de los halos de hidrólisis de cada una de las cinco cepas, se encontró, que la mejor cepa era la AA1.

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Tabla Nº 6: Determinación semicuantitativa de la actividad amilolítica de las cepas aisladas y purificadas.

Cepa Promedio Halo de Hidrólisis (cm)

AA1 2.5

AA2 1.2

AA3 1

AA4 0.5

AA5 0.5

Fig. 6: Microorganismos amilolíticos aislados de muestras de compost. a. Cepa AA1. b. Cepa AA2.

a. b.

(Fuente: Autores)

Koch et al., (1997) reportan que una cepa con actividad enzimática alta, es aquella que genera halos de hidrólisis con diámetros superiores a 5 mm. Sin embargo, de las cinco cepas aisladas ninguna presentó valores inferiores al parámetro mencionado.

Debido a que este es un método semicuantitativo, la actividad amilolítica de cada una las cepas, fue evaluada posteriormente por un método cuantitativo.

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6.2.2. Selección de cepas por antagonismo

No se presentó antagonismo ninguno entre las cinco cepas evaluadas (tabla Nº 7), por lo cual son considerados aptos para su utilización en el inoculante mixto.

Tabla Nº 7: Resultados de las pruebas de antagonismo realizadas con las 5 cepas aisladas. Cepa AA1 AA2 AA3 AA4 AA5

AA1 - - - - -

AA2 - - - - -

AA3 - - - - -

AA4 - - - - -

AA5 - - - - -

De manera simultánea, se hicieron controles de los microorganismos a evaluar como antagonista, sembrándolos por separado en el mismo medio y bajo las mismas condiciones de incubación, con el fin de garantizar su viabilidad y conservación de la actividad amilolítica.

6.2.3. Curvas de Crecimiento

La actividad amilolítica inicial de todas las cepas fue muy cercana, reportando valores desde 26137 UA y 26554 UA, para las cepas AA2 y AA4 respectivamente (Fig. 7). Valores altos, comparados con lo reportado por Goya et al., (2005), de 9396 UA en la degradación de harina de papa.

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Fig. 7: Cuantificación individual de la actividad amilolítica de los microorganismos aislados.

Todas las cepas excepto la AA5, mantuvieron la producción de enzimas del tiempo cero, durante las primeras 2 horas, mientras que la cepa AA5 mostró un incremento de casi 1000 UA durante el mismo periodo de tiempo, esto indica una fase de adaptación de todas las cepas excepto AA5.

Las cepas AA1 y AA5, luego de tener un aumento en la producción de amilasas, mostraron una disminución de la misma al cabo de 8 horas y un posterior aumento de la actividad amilolítica. En el primer caso (AA1), esta disminución en la actividad puede estar referida a una inhibición por producto (Mathews et al., 2002), puesto que en la hora 6 se observó la máxima producción de amilasas e inmediatamente después se produjo el descenso. Si bien para AA5 el descenso no estuvo antecedido por la máxima producción, el valor inmediatamente anterior es muy cercano al máximo y además alto (25000 UA), por lo cual también puede ser considerada una inhibición por producto.

Las cepas que reportaron mayor actividad enzimática fueron AA1 y AA2, que fue lo estimado previamente, al hacer la determinación semicuantitativa de la actividad enzimática. Seguidas por las cepas AA3, AA4 y finalmente AA5 con la menor producción.

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De manera simultánea a la cuantificación de la actividad enzimática, se determinó el crecimiento en biomasa (Fig. 8) de los diferentes microorganismos aislados, por medio del recuento en placa en agar almidón 1% (p/v).

Fig. 8: Curva de Crecimiento de los microorganismos aislados, en medio almidón 1% (p/v).

Al determinar el comportamiento de la biomasa para cada uno de los microorganismos, se halló que las cepas AA1, AA2 y AA3, presentaron una fase de adaptación que tuvo una duración de 2 horas. Esta fase de adaptación coincide con el comportamiento constante que presentó la actividad amilolítica para estos microorganismos, durante el mismo intervalo de tiempo. A partir de la hora 2, estas cepas incrementaron la actividad amilolítica en 8000 UA, lo cual se vio reflejado en un aumento repentino de la biomasa celular que incrementó en 2 unidades exponenciales, para los dos microorganismos.

Por su parte, las cepas AA4 y AA5 no evidenciaron una fase de adaptación sino que presentaron un aumento proporcional en las UFC/mL, que en el caso de la cepa AA5 coincide con el incremento en la actividad amilolítica reportada desde el tiempo cero.

Las cepas que evidenciaron mayor aumento en su biomasa fueron AA1 y AA2, lo que era de esperarse puesto que estas dos cepas fueron las que sintetizaron mayor cantidad de amilasas. Además para las dos cepas la máxima biomasa reportada estuvo antecedida por el valor máximo de actividad amilolítica.

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