PCR Cuantitativa
6.2.2. Aislamiento del RNA total:
Las biopsias renales obtenidas durante la cirugía fueron inmediatamente congeladas y almacenadas en nitrógeno líquido. El RNA total (RNAt) fue aislado por el método del guanidinio-isotiocianato tal y como lo describe (Chirwin et al.) Las biopsias renales corticales fueron homogeneizadas en una solución que contiene guanidinio-isotiocianato 4.0M y 2- mercaptoethanol 0.14M con Polytron® (Kinematica). El homogenado obtenido se dispensó sobre una solución de cloruro de cesio 5.7M y fue centrifugado a 140.000xg durante 18 horas a 20°C (L8-M Beckman Ultracentrifuge). El pellet fue resuspendido en agua tratada con dietilpirocarbonato (H2O-DEPC; Ambion), precipitado con acetato sódico 3.0M y etanol absoluto, lavado con etanol 70% (v/v) y resuspendido de nuevo en H2O-DEPC. La cuantificación y pureza del RNAt se realizó por espectrofotometría ultravioleta a 260-280nm y la integridad se valoró por visualización de los RNA ribosómicos (rRNA) 18S y 28S en gel de agarosa desnaturalizante al 1% (figura 8, página 115). El RNAt fue congelado y almacenado a
-80°C hasta su uso en la retrotranscripción 355.
6.2.3. Retrotranscripción (RT)
4 µg de RNAt se retrotranscribieron a cDNA en una reacción que contenía RT buffer 1X (50mM Tris-HCl, 50mM KCl, 10mM MgCl2, 0.5mM espermidina, 1.0mM DTT)(Promega), 500µg/ml de ramdom primers (Promega), 1.0mM deoxinucleótidos (dNTPs)(Boehringer Mannheim), 20U de inhibidor de las RNAsas (Rnasin; Amersham Pharmacia Biotech) y 15U de transcriptasa reversa del virus del mioblastoma aviar (AMV; Promega). La síntesis del cDNA se realizó en un termociclador PTC-200 DNA Engine® (MJ-Research) durante 1h a 42°C y posteriormente se desnaturalizó la AMV durante 5’ a 95°C. Se realizaron dos controles en este paso que después se sometieron a PCR: el primero verifica la posible contaminación de DNA
genómico en el RNAt (AMV-) y el segundo controla la posible contaminación de amplicones en los reactivos de la retrotranscripción (RNA-). Las RTs se mantuvieron a 4°C hasta su uso por no más de 24h. Previa a la reacción encadenada de la polimerasa (PCR) cuantitativa las RT y
sus respectivos controles fueron diluidos en ¼ en H2O 355.
PCR cuantitativa para TGF-β1
Para cada una de las 5 retrotranscripciones (RT) de cada animal se realizó una PCR cuantitativa compuesta por un total de 12 reacciones:
• 7 diluciones de EI-MIMIC que comprendían el intervalo desde 1.0x105 a 1.4x102 moléculas
por tubo.
• 2 controles positivos, uno conteniendo cDNA (RT+) y otro conteniendo EI-MIMIC (EI- MIMIC+)
• 3 controles negativos: el control de genómico (AMV-), el control de reactivos de la retrotranscripción (RNA-), y el control de reactivos de la PCR sin cDNA ni EI-MIMIC (H2O).
La mezcla de reacción estaba compuesta por: buffer de PCR 1X (10 mM Tris-HCl, pH 8.3; 50 mM KCl; Ecogen), 2.0mM dNTPs (Boehringer Mannheim), 0.25µM de cebadores (sentido 5’ GCC GCT GCT GCT GCC GCT GCT GT; antisentido 5’ TCA TAG ATT TGG TTG CCG CTT TC), 0.9mM MgCl2 y 0.5U Taq DNA polimerasa (Ecogen). Las reacciones que formaban parte de la curva estándar de la PCR cuantitativa contenían 32µl de la mezcla de reacción, 4µl de EI-MIMIC y 4µl de cDNA (diluido ¼). Las muestras así preparadas se dispusieron en un PTC-200 DNA-Engine® (MJ-Research) en las siguientes condiciones: desnaturalización a 94°C 5’ y 35 ciclos de PCR compuestos por desnaturalización a 94°C 30’’, annealing a 57°C 30’’ y extensión a 72°C 30’’. Se incluyó una extensión final de 72°C 5’.
Posteriormente, los productos de PCR se separaron por electroforesis en agarosa-nusieve al 2.5% (Pronadisa®) durante 90’ a 6V/cm y fueron teñidos con bromuro de etidio. El competidor MIMIC presenta un tamaño de 196pb, mientras que el cDNA para TGF-β1 rinde una banda de 339pb. Los geles fueron fotografiados con el sistema Kodak DC120 Digital Access® y las intensidades cuantificadas por densitometría mediante el programa Phoretix-1D® (Nonlinear
Dynamics). Un experimento representativo de la cuantificación de TGF-β1 se muestra en las
(figura 8B, página 115). Los controles negativos se muestran en la (figura 8C, página 115) 354.
El cociente entre las densidades corregidas por tamaños de EI-MIMIC y cDNA (factor de corrección: EI-MIMICx1.73) se representaron en función de la cantidad inicial de EI-MIMIC presente en cada reacción y sometida a regresión lineal por medio de GraphPad Prism® 3.0 (GraphPad Software Inc). El punto de corte con el eje de abcisas representa la cantidad inicial de cDNA presente en la muestra. El resultado final se expresa como moléculas de TGF-β1/µg de RNAt (figura 8B, página115). Antes de normalizar los resultados con logaritmo natural (ver ANÁLISIS ESTADÍSTICO), el coeficiente de variación intraensayo (%CVi) para la suma de RT, PCR cuantitativa y densitometría fue del 21.2% (n=8), tras la normalización el %CVi se fijó en 2.8%.
Amplificación de 18S rRNA como housekeeping
En este estudio se decidió sustituir el gen housekeeping GAPDH presente en el EI- MIMIC por la valoración semicuantitativa de 18S rRNA con la finalidad de confirmar tanto la celularidad como la valoración de los RNA testados. Existen evidencias (Zhong et al.) que indican que GAPDH es muy variable bajo condiciones de hipoxia y se sugiere que estas variaciones serían más acusadas durante la isquemia que sufre el riñón durante el transplante. De entre todos los genes housekeeping revisados por este grupo bajo condiciones de hipoxia el 28S fue el menos variable (28S y 18S se transcriben en un mismo rRNA 45S que es
Se diseñaron unos cebadores específicos para 18S rRNA: (Nº Acceso: AF179868, AF102857): sentido 5’ CGT CCC CGC CCC TTG CCT CT; antisentido 5’ GCT TTC GCT CTG GTC CGT CTT que generan un producto de 271bp. Se testaron varias diluciones del cDNA a distintos ciclos de PCR con tal de determinar la linearidad de la PCR. Las condiciones finales fueron: PCR buffer 1x (10 mM Tris-HCl, pH 8.3; 50 mM KCl; Ecogen), 2.0mM dNTPs (Boehringer Mannheim), 0.5µM de cebadores, 2.0mM MgCl2 y 0.5U Taq DNA polimerasa (Ecogen). El cDNA se diluyó 1/40 y 4.0µl fueron sometidos a 22 ciclos de amplificación bajo las siguientes condiciones: desnaturalización a 94°C 5’ y 35 ciclos de PCR compuestos por desnaturalización a 94°C 30’’, annealing a 60°C 30’’ y extensión a 72°C 30’’. Se incluyó una extensión final de 72°C 5’. Posteriormente, los productos de PCR se cargaron en agarosa 2.0% (Pronadisa®), se hicieron correr 60’ a 6V/cm y fueron teñidos con bromuro de etidio (figura 8D página 115). Las imágenes fueron adquiridas y tratadas como en el caso de TGF- β1. Los resultados se expresan como unidades arbitrarias de densitometría (UAD). El %CVi para la suma de la RT, PCR semicuantitativa y densitometría fue del 4.4% (n=7).
Figura 8A: Aislamiento de RNA total
Figura 8B y 8C: PCR cuantitativa para TGF-beta1
Figura 8D: Amplificación del 18S rRNA como housekeeping.