Aislamiento y análisis de ácidos nucleicos 59 

Se utilizó el vector de entrada Gateway (Invitrogen) pENTRY/D-TOPO para la clonación de la región codificante de la proteína madura CS26, y el vector de destino Gateway pDEST17, con resistencia a ampicilina, para la expresión en bacterias de la proteína recombinante con una cola de His en el extremo aminoteminal.

Para la generación de la línea complementada de CS26 se utilizó el plásmido pMDC32 (Curtis y Grossniklaus, 2003) compatible con la tecnología Gateway (Invitrogen), que permite que CS26 esté bajo el control de un doble promotor CAMV35S y confiere a las plantas resistencia a higromicina.

4.2. Amplificación de fragmentos de DNA mediante PCR

En general, para las reacciones en cadena de la polimerasa se empleó Taq DNA polimerasa (Invitrogen). Siguiendo las indicaciones de la casa comercial, la mezcla de reacción contenía, además del DNA o cDNA molde, MgCl2 1,5 mM, dNTPs 0,2 mM,

oligonucleótidos directo y reverso 0,5 µM cada uno (Tabla S1), DNA polimerasa 2,5 U y el correspondiente tampón comercial 1x. Las condiciones de reacción constaron de una etapa inicial de desnaturalización de 2 min a 94 ºC, seguida de 30-35 ciclos sucesivos de desnaturalización (1 min, 94 ºC), hibridación (1 min, 45-65 ºC) y extensión (1 min, 72 ºC), y una etapa final de elongación de 5 min a 72 ºC.

4.3. Electroforesis de DNA

Los productos de PCR se visualizaron en geles de agarosa al 1 % (p/v) en tampón TBE (0,5x), teñidos con bromuro de etidio 1 µg/mL y separados electroforéticamente con una corriente eléctrica de 100 V. Las muestras se cargaron en presencia de tampón de carga.

Tampón de carga: Azul de bromofenol 0,25 % (p/v) y ficoll 15 % (p/v).

4.4. Secuenciación de DNA

Las secuenciaciones de DNA realizadas durante este trabajo se llevaron a cabo en el Servicio de Genómica de la empresa Newbiotechnic, S.A.

4.5. Extracción de RNA

El RNA total para RT-PCR y qPCR se aisló de hojas de Arabidopsis utilizando el kit comercial “RNeasy Plant Mini Kit” (Qiagen), siguiendo las especificaciones del fabricante. El DNA se eliminó mediante tratamiento en columna con Dnasa I libre de RNasa (RNase-free DNase Set, Qiagen), según el protocolo recomendado por el kit.

Para los ensayos de hibridación con micromatrices de DNA, la extracción del RNA se realizó utilizando “Trizol Max Reagent” (Invitrogen). Brevemente, se homogeneizó el material triturado en N2 líquido (50-100 mg) con 1 mL del reactivo y se

incubó a temperatura ambiente durante 5 min. A continuación se le añadió 200 µL de cloroformo y se centrifugó a 950 g durante 15 min a 4ºC. Por último, el RNA se precipitó con isopropanol, y el precipitado se resuspendió en 100 µL de agua tratada con DEPC. A continuación, los RNAs aislados se sometieron a un último paso de limpieza con el kit “RNeasy Plant Mini Kit” (Qiagen), tratándose posteriormente con DNasa libre de RNasa (“RNase-free DNase I Set”, Qiagen) según las indicaciones del fabricante.

Los RNAs se cuantificaron mediante la determinación de la absorbancia a 260 nm, a excepción de aquellos destinados al análisis por qRT-PCR y chips de DNA. En el primer caso, la calidad y concentración del RNA se determinó utilizando el sistema de electroforesis automatizada Experion (Bio-Rad). En el segundo, se empleó el Bioanalyzer 2100 (Agilent).

Materiales y métodos

4.6. Síntesis de cDNA

Una vez aislado y cuantificado el RNA según se ha descrito con anterioridad, se procedió a la síntesis de cDNA mediante reacción de transcripción reversa con el kit “SuperScriptTM _{First-Strand” (Invitrogen), siguiendo las indicaciones del fabricante. Se}

empleó oligo dT como cebador de la reacción.

4.7. Análisis de RNA mediante PCR cuantitativa en tiempo real (qPCR)

Se analizó la expresión de distintos genes mediante PCR cuantitativa en tiempo real. Para ello, se diseñaron oligonucleótidos específicos de cada gen utilizando los programas “Vector NTI Advance 10” (Invitrogen). Todos los oligos debían tener una Tm de 60 ± 1 ºC, un contenido de G y C entre 40-50 % y dar lugar a un amplicón de 80-

100 pb.

Para la reacción de qPCR se utilizó el kit “iQ SYBR Green Supermix” (Bio- Rad), usando un termociclador iQTM5 (Bio-Rad). Las reacciones se llevaron a cabo en un

volumen final de 20 µL conteniendo: “iQ SYBR Green Supermix” 1x, oligonucleótidos directo y reverso 100 nM cada uno y cDNA 1 ng/µL. Se realizaron dos réplicas experimentales por muestra y tres réplicas biológicas independientes para cada condición. Previo a cada reacción de qPCR se analizó la integridad del cDNA, mediante esta misma técnica, utilizando parejas de oligonucleótidos diseñados en los extremos 5’ y 3’ del gen de expresión constitutiva GADPH (codifica la subunidad C de la gliceroaldehido-3-fosfato deshidrogenasa) (Tabla S1).

El programa de PCR utilizado constaba de una etapa inicial de desnaturalización de 10 min a 95 ºC, seguida de 45 ciclos sucesivos de desnaturalización (15 s, 95 ºC) e hibridación (1 min, 60 ºC). Para confirmar la presencia de un único producto de amplificación, así como la ausencia de dímeros de los oligonucleótidos, se analizaron las curvas de disociación de cada uno de los amplicones (55-90 ºC, ΔT: 0,3 ºC s-1_).

Los niveles de expresión de los distintos genes se calcularon mediante cuantificación relativa respecto a los valores obtenidos para la línea silvestre (calibrador). Se utilizó como control normalizador el gen UBQ10 (que codifica la poliubiquitina 10) de expresión constitutiva en A. thaliana. Las veces de cambio para cada gen se calcularon mediante el método de 2–ΔΔCt (Livak y Schmittgen, 2001).

ΔCt (muestra) = Ct (muestra) – Ct (normalizador) ΔCt (calibrador) = Ct (calibrador) – Ct (normalizador)

ΔΔCt = ΔCt (muestra) – ΔCt (calibrador) Veces de cambio = 2–ΔΔCt

Los resultados obtenidos se presentan como el valor medio de las veces de cambio ± desviación estándar.

4.8. Análisis de perfiles transcripcionales mediante micromatrices de DNA

Se analizaron los perfiles transcripcionales de hojas de plantas silvestres y mutantes cs26 crecidas bajo las condiciones de regímenes de día largo y día corto. Se extrajo RNA de hojas utilizando el método del “Trizol Max Reagent” (apartado 4.5). Se realizaron tres réplicas biológicas independientes por línea y por condición.

La síntesis de cDNA, el marcaje de cRNA y la hibridación de los chips ATH1 de Affymetrix se llevaron a cabo en la Unidad de Genómica del Centro Nacional de Biotecnología (CNB, Madrid), utilizando los protocolos recomendados por Affymetrix. De igual manera, el análisis de los valores obtenidos se realizó en esta misma unidad, utilizando el software affylmGUI R (Wettenhall et al., 2006).

Para la normalización de los datos se empleó el método RMA (“Robust Microarray Average”) (Irizarry et al., 2003). El análisis estadístico de las diferencias de expresión génica se llevó a cabo siguiendo la metodología Limma (“Linear Models for Microarrays Data”), que forma parte del programa AffylmGUI. Los valores de P se corrigieron utilizando el método de Benjamini-Hochberg (Klipper-Aurbach et al., 1995; Reiner et al., 2003), considerándose estadísticamente significativos sólo aquellos que presentaban valores de FDR menores de 0,05. También se adoptó como valor de corte dos veces de cambio, así como lgSeñal > 7 para discriminar aquellos genes con la expresión alterada.

La clasificación de los genes en categorías funcionales se realizó utilizando el software Map-Man (http://gabi.rzpd.de/projects/Map-Man/) (Thimm et al., 2004) y las bases de datos de TAIR (http://www.arabidopsis.org) y de Bio-Array Resource (http://bar.utoronto.ca/).

5. Aislamiento y análisis de proteínas